Краткий конспект подготовки к ЗНО по биологии №28 «Высшая нервная деятельность»

Подготовка к ЗНО. Биология.
Конспект 28. Высшая нервная деятельность

Высшая нервная деятельность (ВНД) – это деятельность коры больших полушарий головного мозга и ближайших к ней подкорковых образований, обеспечивающая наиболее совершенное приспособление (поведение) высокоорганизованных животных и человека к окружающей среде. Ее основой являются условные рефлексы.
Безусловные рефлексы – врожденные рефлексы, передаваемые по наследству от родителей. Они являются видовыми, относительно постоянными и осуществляются низшими отделами ЦНС – спинным мозгом, стволом н подкорковыми ядрами головного мозга.
Инстинкты – система врожденных безусловнорефлекторных поведенческих реакций, связанных с продолжением и сохранением вида.
Условный рефлекс – это приобретенный рефлекс, свойственный отдельному индивиду (особи).Возникают в течение жизни особи при определённых условиях и исчезают при их отсутствии, не закрепляются генетически (не передаются по наследству). Формируются на базе безусловных рефлексов при участии высших отделов мозга.

Образование и биологическое значение условных рефлексов. Условные рефлексы образуются в результате сочетания безусловного рефлекса с действием условного раздражителя. Для этого необходимо соблюдение двух условий:

1. действие условного раздражителя должно обязательно несколько предшествовать действию безусловного раздражителя.

2. условный раздражитель должен неоднократно подкрепляться действием безусловного раздражителя.
Торможение условных рефлексов.

При изменении условий существования в организме образуются новые условные рефлексы, а выработанные ранее ослабляются или исчезают благодаря процессу торможения.
Сигнальная система – совокупность процессов в нервной системе, которые осуществляют восприятие, анализ информации и ответную реакцию организма.
Первая сигнальная система деятельность коры больших полушарий мозга, которая связана с восприятием через рецепторы непосредственных раздражителей (сигналов) внешней среды, например световых, тепловых, болевых и т. д.
Вторая сигнальная система сформировалась у человека вследствие общественного образа жизни и коллективного труда и выступала средством общения. Это речь, письмо
Память – одна из психических функций и видов умственной деятельности, предназначенная сохранять, накапливать и воспроизводить информацию.
Сон – специфическое состояние нервной системы, проявляющееся в выключении сознания, угнетении двигательной активности, снижении обменных процессов и всех видов чувствительности. Фазы сна: медленный и быстрый сон.

Онлайн-тест подготовки к ЗНО по биологии №28 «Высшая нервная деятельность. Рефлексы. Инстинкты. Память»

Кафедра Высшей нервной деятельности и психофизиологии сегодня

Кафедра высшей нервной деятельности является одним из ведущих научно-образовательных центров нашей страны по исследованию нейробиологических и психофизиологических основ поведения человека и животных и подготовке высококвалифицированных специалистов в области нейрофизиологии и психофизиологии. Кафедра сегодня — это большой коллектив единомышленников, состоящий из более 20 преподавателей и научных сотрудников. На кафедре работают 5 докторов и 10 кандидатов наук, все они являются выпускниками кафедры. Кафедра ведет учебную работу по образовательным программам бакалавриата по направлению подготовки 06.03.01 Биология и магистратуры по направлению подготовки 06.04.01 Биология, профиль «Физиология, биохимия, биофизика». Сотрудники кафедры выполняют базовые, элективные и курсы специализации бакалавриата, проводят практики для студентов. Авторские магистерские курсы тематически связаны с основными направлениями научной деятельности кафедры. Аспирантура и докторантура кафедры ведут подготовку по специальностям 19.00.02 Психофизиология, 03.03.01 Физиология. Студенты бакалавриата, магистратуры и аспиранты — это важнейшая часть кафедрального коллектива. Студенты и аспиранты активно включаются в разработку основных исследовательских направлений, развиваемых на кафедре, обогащая тем самым свой профессиональный потенциал. Научная работа на кафедре ведется в пяти лабораториях: психофизиологии, физиологии сенсомоторных систем, электроэнцефалографии, Научном центре психофизиологии матери и ребенка и группе исследования детской речи. В центре научной деятельности кафедры лежит проблема комплексного исследования психофизиологических механизмов когнитивных функций и эмоциональных состояний, разработка которой ведется по следующим основным направлениям: Изучение механизмов когнитивных функций, прежде всего памяти и обучения, внимания, принятия решений. Исследование мозговых механизмов согласования деятельности сенсорных и моторных систем (сенсомоторной координации) как основы психических функций мозга человека. Исследование деятельности головного мозга человека при помощи регистрации биопотенциалов головного мозга. Изучение ранних этапов развития когнитивных функций в зависимости от условий протекания пренатального развития. Исследование нейробиологических особенностей формирования социального поведения и влияния нейрогормонов на поведение животных в норме и на фоне стресса. Комплексное изучение различных аспектов становления речи ребенка с ранних этапов онтогенеза и выявления роли разных факторов в овладении речью и языком. Успешному развитию научно-педагогической деятельности на кафедре способствует тесная связь со многими академическими учреждениями, в том числе Институтом мозга человека РАН, Институтом физиологии им. И.П.Павлова РАН, Институтом эволюционной биохимии и физиологии им. И.М.Сеченова РАН, Педиатрической Медицинской Академией, на базе которых многие студенты выполняют свои квалификационные работы. Кафедра осуществляет активное научно-образовательное сотрудничество с российскими и зарубежными университетами и исследовательскими лабораториями (University of Helsinki, Finland; F.C. Donders Center, The Netherlands; University of Gavle, Sweden; Высшая школа экономики, Москва).

Тест по теме «высшая нервная деятельность человека»

ВЫСШАЯ НЕРВНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕКА

1. Какой из перечисленных ниже рефлексов является безусловным?

А. Выделение слюны при показе пищи

Б. Реакция собаки на голос хозяина

В. Отдергивание руки от горячего предмета

2. Если в комнате, где у собаки вырабатывается слюноотделительный рефлекс на зажигание лампочки, включается неожиданно приемник, то его звук…

А. Является условным раздражителем

Б. Является безразличным раздражителем

В. Является безусловным раздражителем

Г. Вызывает торможение рефлекса

3. Условный рефлекс будет прочным, если условный раздражитель.

А. Постоянно подкреплять безусловным

Б. Подкреплять безусловным нерегулярно

В. Не подкреплять безусловным

Г. То подкреплять безусловным, то длительно не подкреплять

4. Какой признак характерен для безусловного рефлекса?

А. Характерен для всех особей данного вида

Б. Приобретается в течение жизни

В. Не передается по наследству

Г. Вырабатывается у каждой особи вида

5. К высшей нервной деятельности относят:

А. Мыслительную, речевую деятельность и память

Б. Группу ориентировочных рефлексов

В. Инстинкты

Г. Рефлексы, обеспечивающие органические потребности (голод, жажда и др.)

6. Что такое потребность?

А. Сложный комплекс приспособительных двигательных актов, направленных на удовлетворение имеющейся у организма потребности

Б. Нужда в чем-либо необходимом для поддержания жизни и развития организма

В. Внутренний мир человека

Г. Основная форма деятельности нервной системы.

7. Какая форма высшей нервной деятельности характерна для человека?

А. Условные рефлексы

Б. Безусловные рефлексы

В. Мышление

Г. Элементарная рассудочность

8. Большой вклад в учение о высшей нервной деятельности внес

А. И.И. Мечников

Б. И.П. Павлов

В. Луи Пастер

Г. Н.А. Семашко

9. Во время сна деятельность мозга:

А. Прекращается на все время сна

Б. Прекращается на время медленного сна

В. Не меняется вовсе

Г. Перестраивается, циклически изменяясь на протяжении всего сна

10. Инстинкт — это:

А. Генетически закрепленное поведение

Б. Приобретенный в течение жизни опыт

В. Поведение, обусловленное целенаправленным обучением

11. Что, по И.П. Павлову, является «чрезвычайной прибавкой к механизмам работы мозга?

А. Рассудочная деятельность

Б. Эмоции:

В. Речь

12. Первая сигнальная система:

А. Анализирует знаковые сигналы, поступающие в виде символов (слов, знаков, изображений) Б. Анализирует сигналы, идущие из внешней среды

В. Анализирует оба типа сигналов

13. Важнейшая функция речи — это:

А. Обобщение и абстрактное мышление

Б. Обозначение конкретных примеров

В. Выражение эмоций

14. Сновидения возникают в период

А. Медленного сна

Б. Быстрого сна

В. В обоих случаях

15. Ухаживание кошки за котятами — это:

А. Условный рефлекс

Б. Сложная цепь безусловных рефлексов

В. Сочетание навыков и безусловных рефлексов

16. Сосредоточенность сознания на том или ином виде деятельности, объекте:

А.Эмоции

Б. Внимание

В. Память

17. Какая из форм торможения передается по наследству?

А. Внешнее

Б. Внутреннее

В. Таких не существует

18. Чего нельзя увидеть в сновидениях?

А. Прошлое

Б. Настоящее

В. Будущее

19. Чем условный рефлекс отличается от безусловного?

20. Какое значение для организма имеет сон?

21. Чем отличается мышление человека от рассудочной деятельности животных?

Ответы

1 — В; 2 — Г; 3 — А; 4 — А; 5 — А; 6 — Б; 7 — В; 8 — Б; 9 —Г; 10—А; 11 — В; 12 — В;

13 —А; 14—А; 15 —Б; 16 — Б; 17 — Б; 18 — В; 19 — безусловные рефлексы передаются по наследству, а условные рефлексы вырабатываются после рождения в процессе жизни; 20 — от­дых мозга, активная перестройка его работы, необходимая для упорядочивания полученной информации в период бодрствования; 21 — мышление — это способ на основе известных знаний добывать новую информацию, обобщать известные факты. Рассудочная деятельность — это высшая форма приспособления к условиям среды.

«Высшая нервная деятельность человека» | Тест по биологии (8 класс) по теме:

ВЫСШАЯ НЕРВНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕКА

Вариант I

1.        Какой из перечисленных ниже рефлексов является безусловным?

А. Выделение слюны при показе пищи

Б. Реакция собаки на голос хозяина

В. Отдергивание руки от горячего предмета

2.        Если в комнате, где у собаки вырабатывается слюноотделительный рефлекс на зажигание лампочки, включается неожиданно приемник, то его звук…

А. Является условным раздражителем

Б. Является  безразличным раздражителем

В. Является  безусловным раздражителем

Г. Вызывает  торможение рефлекса

3. Условный рефлекс будет прочным, если условный раздражитель.

А. Постоянно подкреплять безусловным

Б. Подкреплять безусловным нерегулярно

В. Не подкреплять безусловным

Г. То подкреплять безусловным, то длительно не подкреплять

4. Какой признак характерен  для безусловного рефлекса?

А. Характерен для всех особей данного вида

Б. Приобретается в течение жизни

В. Не передается по наследству

Г. Вырабатывается у каждой особи вида

5.        К высшей нервной деятельности относят:

А. Мыслительную, речевую деятельность и память

Б. Группу ориентировочных рефлексов

В. Инстинкты

Г. Рефлексы, обеспечивающие органические потребности (голод, жажда и др.)

6.        Что такое потребность?

А. Сложный комплекс приспособительных двигательных актов, направленных на удовлетворение имеющейся у организма потребности

Б. Нужда в чем-либо необходимом для поддержания жизни и развития организма

В. Внутренний мир человека

Г. Основная форма деятельности нервной системы.

7. Какая форма высшей нервной деятельности характерна для человека?

А. Условные рефлексы

Б. Безусловные рефлексы

В. Мышление

Г. Элементарная рассудочность

8.        Большой вклад в учение о высшей нервной деятельности  внес

А. И.И. Мечников

Б. И.П. Павлов

В. Луи Пастер

Г. Н.А. Семашко

9.        Во время сна деятельность мозга:

А. Прекращается на все время сна

Б. Прекращается на время медленного сна

В. Не меняется вовсе

Г. Перестраивается, циклически изменяясь на протяжении всего сна

10. Инстинкт — это:

А. Генетически закрепленное поведение

Б. Приобретенный в течение жизни опыт

В. Поведение,   обусловленное   целенаправленным обучением

11. Что, по И.П. Павлову, является «чрезвычайной прибавкой к механизмам работы мозга?

А. Рассудочная деятельность

Б. Эмоции:

В. Речь

12.        Первая сигнальная система:

А. Анализирует знаковые сигналы, поступающие в виде символов (слов, знаков, изображений) Б. Анализирует сигналы, идущие из внешней среды

В. Анализирует оба типа сигналов

13.        Важнейшая функция речи — это:

А. Обобщение и абстрактное мышление

Б. Обозначение конкретных примеров

В. Выражение эмоций

14. Сновидения возникают в период

А. Медленного сна

Б. Быстрого сна

В. В обоих случаях

15. Ухаживание кошки за котятами — это:

А. Условный рефлекс

Б. Сложная цепь безусловных рефлексов

В. Сочетание навыков и безусловных рефлексов

16. Сосредоточенность сознания на том или ином виде деятельности, объекте:

А.Эмоции

Б. Внимание

В. Память

17. Какая из форм торможения передается по наследству?

А. Внешнее

Б. Внутреннее

В. Таких не существует

18. Чего нельзя увидеть в сновидениях?

А. Прошлое

Б. Настоящее

В. Будущее

19. Чем условный рефлекс отличается от безусловного?
20. Какое значение для организма имеет сон?
21. Чем отличается мышление человека от рассудочной деятельности животных?

Вариант I

22. 1 — В; 2 — Г; 3 — А; 4 — А; 5 — А; 6 — Б; 7 — В; 8 — Б; 9 —Г; 10—А; 11 — В; 12 — В;
23. 13 —А; 14—А; 15 —Б; 16 — Б; 17 — Б; 18 — В; 19 — безусловные рефлексы передаются по наследству, а условные рефлексы вырабатываются после рождения в процессе жизни; 20 — отдых мозга, активная перестройка его работы, необходимая для упорядочивания полученной информации в период бодрствования; 21 — мышление — это способ на основе известных знаний добывать новую информацию, обобщать известные факты. Рассудочная деятельность — это высшая форма приспособления к условиям среды.

ВЫСШАЯ НЕРВНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕКА

Вариант II

1. Какой из перечисленных ниже рефлексов является условным?

А. Выделение слюны при показе пищи

Б. Реакция собаки на голос хозяина

В. Отдергивание руки от горячего предмета

2.        Если у собаки вырабатывается условный слюноотделительный рефлекс на зажигание электрической лампочки, то пища в этом случае…

А. Является условным раздражителем

Б. Является безразличным раздражителем

В. Является безусловным раздражителем

Г. Вызывает торможение рефлекса

3.        Какие формы высшей нервной деятельности наблюдаются у животных?

А. Только безусловные и условные рефлексы

Б. Безусловные и условные рефлексы и элементарная рассудочная деятельность

В. Мышление

Г. Только элементарная рассудочная деятельность

4.        Условный рефлекс…

А. Характерен для всех особей данного вида

Б. Приобретается в течение жизни

В. Передается по наследству

Г. Является врожденным

5.        Какая из форм высшей нервной деятельности соотносится с умением решать математические задачи?

А. Условные рефлексы

Б. Безусловные рефлексы

В. Абстрактное мышление

Г. Элементарная рассудочная деятельность

6.        В комнате, где у собаки вырабатывается слюноотделительный рефлекс на зажигание лампочки, постоянно включено радио. Радио в этом случае выступает как…

А. Условный раздражитель

Б. Безразличный раздражитель

В. Безусловный раздражитель

Г. Фактор, вызывает торможение рефлекса

7. В период быстрого сна

А. Снижается температура

Б. Замедляется дыхание

В. Происходит движение глазных яблок под закрытыми веками

Г. Понижается кровяное давление

8.        Ответная реакция организма на раздражение рецепторов при участии и контроле нервней системы называется:

А. Гуморальной регуляцией

Б. Рефлексом

В. Автоматизмом

Г. Сознательной деятельностью

9.        Во время сна деятельность мозга:

А. Прекращается на все время сна

Б. Прекращается на время медленного сна

В. Не меняется вовсе

Г. Перестраивается, циклически изменяясь на протяжении всего сна

10. Прямо перед школьником неожиданно на большой скорости проехала машина. Он остановился как вкопанный. Почему?

А. Сработало внешнее торможение

Б. Сработал условный рефлекс

В. Сработало внутреннее торможение

11. Вторая сигнальная система:

А. Анализирует знаковые сигналы, поступающие в виде символов (слов, знаков, изображений) Б. Анализирует сигналы,  идущие из внешней среды

В. Анализирует  оба типа сигналов

12.Рассудочная деятельность — это…

А. Высшая форма приспособления к условиям среды

Б. Способность говорить

В. Способность использовать орудия труда

13. Сновидения возникают в период

А. Медленного сна

Б. Быстрого сна

В. В обоих случаях

14. Засыпание человека происходит:

А. Только рефлекторно

Б. Под влиянием гуморальных процессов

В. Под влиянием гуморальных и рефлекторных процессов

15. Кто первым объяснил рефлекторный принцип работы головного мозга?

А. И. П. Плодов

Б. А. Л. Ухтомский

В. И.М. Сеченов

Г. II.И. Анохин

16. Что  И.П. Павлов понимал под названием «сигналы сигналов»?

А. Первую сигнальную систему

Б. Вторую сигнальную систему

В. Рефлекс

17. Переживания,  в которых проявляются отношения людей к окружающему миру и к самому себе, называются:

А. Обучением

Б. Памятью

В. Эмоциями

18. Каково биологическое значение торможения условных рефлексов?

19. Что формируется труднее: знания, умения или навыки?

20.Как по-другому можно назвать цепочку условных рефлексов?

Вариант II

1 — Б; 2 — В; 3 — Б; 4 — Б; 5 — В; 6 — Г; 7 — В; 8 — Б; 9 —Г; 10—А; 11—А; 12 —А; 13 — Б; 14 —В; 15 —В; 16 — Б; 17 — В; 18 — позволяет приспособиться к конкретным условиям существования; 19 — умения; 20 — динамический стереотип.

Высшая нервная деятельность человека ее типы, психика, темперамент (Таблица, Схема)

Высшая нервная деятельность человека

Высшая нервная деятельность (ВНД) — деятельность высших отделов центральной нервной системы, обеспечивающая наиболее совершенное приспособление животных и человека к внешней среде.

Психика — это внутренний мир человека, принадлежащая конкрет­ному человеку картина мира, существующая именно в его мозгу.

Поведение — сложный комплекс приспособительных двигательных актов, направленных на удовлетворение имеющейся у организма потребности.

Мышление, или рассудочная деятельность — сложнейший вид мозговой деятельности организма в процессе приспособления к новым условиям и решении новых жизненных задач. Рассудочная деятельность позволяет улавливать закономерности, связывающие предметы и явления окружающей среды, и использовать их в новых условиях в своем поведении.

Эмоции — переживания, в которых проявляется отношение человека к окружающему миру и к самому себе.

Положительные эмоции (радость, восторг, удовлетворение) — активное состояние мозговых структур, побуждающее усилить или повторить данное состояние.

Отрицательные (гнев, ужас, страх, отвращение) — активное состояние мозговых структур, побуждающее к ослаблению или прекращению данного состояния.

К высшей нервной деятельности человека относят такую деятельность — внимание, память, речь и мышление, сон.

Типы высшей нервной деятельности

Тип высшей нервной деятельности — совокупность индивидуальных свойств нервной системы, обусловленных наследственными особенностями индивидиума и eгo жизненным опытом.

Свойства высшей нервной деятельности	Сила процессов возбуждения и торможения
	Взаимная уравновешенность, т.е. соотношение силы процессов возбуждения и торможения
	Подвижность процессов возбуждения и торможения, т.е. скорость, с которой возбуждение может сменяться торможением и наоборот
Типы высшей нервной деятельности	Сильный, уравновешенный, с большой подвижностью нервных процессов («живой», быстрый, подвижный тип)
	Сильный, уравновешенный, с малой подвижностью нервных процессов («спокойный», медленный, малоподвижный, инертный тип)
	Сильный, неуравновешенный, с преобладанием возбуждения над торможением («безудержный тип»)
	Слабый, с быстрой истощаемостью, приводящей к потере работоспособности («тормозной тип»)

Темперамент и его типы

Темперамент — это индивидуальная, своеобразная, обусловленная природой совокупность динамических проявлений психики.

Тип темперамента	Характеристика типов		Психологические особенности
	по Гиппократу	по Павлову
Сангвиник «сангвис» (лат.) — кровь	Тип с преобладанием в организме крови	Сильный, уравновешенный, подвижный тип	Быстро отзывается на окружающие события, стремится к частой смене впечатлений .легко переживает неудачи, подвижный, с выразительной мимикой
Флегматик «флегма” (греч.) — слизь	Тип с преобладанием в организме слизи	Сильный, уравновешенный, медленный тип	Невозмутимый, с устойчивым настроением, с постоянством и глубиной чувств, с равномерностью действий и речи, со слабым внешним выражением чувств
Холерик «холэ» (греч.) — желчь	Тип с преобладанием в организме желчи	Сильный, неуравновешенный тип	Очень энергичный, быстрый, порывистый, с бурным проявлением эмоций, с резкой сменой настроения, страстно отдается делу
Меланхолик «мелайна холэ» (греч.) — черная желчь	Тип с преобладанием в организме черной желчи	Слабый тип	Человек впечатлительный, с глубокими переживаниями, легкоранимый, внешне слабо реагирующий на окружающее

_______________

Источник информации:

Биология в таблицах и схемах./ Издание 2е, — СПб.: 2004.

Резанова Е.А. Биология человека. В таблицах и схемах./ М.: 2008.

Высшая нервная деятельность реферат по биологии

Высшая нервная деятельность Понятие о высшей нервной деятельности Высшая нервная деятельность – сложная форма жизнедеятельности, обеспечивающая индивидуальное поведенческое приспособление человека и высших животных к изменяющимся условиям окружающей среды. Понятия высшая нервная деятельность введено великим русским физиологом И.П. Павловым в связи с открытием условного рефлекса как новой, не известной до этого формы нервной деятельности. И.П. Павлов противопоставил понятие «высшая» нервная деятельность понятию «низшая» нервная деятельность, направленной в основном на поддержание гомеостаза организма в процессе его жизнедеятельности. При этом нервные элементы, осуществляющие взаимодействие внутри организма, объединены нервными связями уже к моменту рождения. И, наоборот, нервные связи, обеспечивающие высшую нервную деятельность, реализуются в процессе жизнедеятельности организма в форме жизненного опыта. Поэтому низшую нервную деятельность можно определить как врожденную форму, а высшую нервную деятельность – как приобретаемую в индивидуальной жизни человека или животного. Истоки противопоставления высшей и низшей форм нервной деятельности восходят к идеям древнегреческого мыслителя Сократа о существовании у животных «низшей формы души», отличающейся от души человека, обладающей «мыслительной силой». Долгие столетия представления о «душе» человека и непознаваемости его психической деятельности оставались в умах людей неразрывными. Лишь в 19 в. в трудах отечественного ученого, основоположника современной физиологии И.М. Сеченова был раскрыт рефлекторный характер деятельности головного мозга. В книге «Рефлексы головного мозга», вышедшей в 1863 г., он первым сделал попытку объективного изучения психических процессов. Идеи И.М. Сеченова блестяще развил И.П. Павлов. На основе разработанного им метода условных рефлексов он показал пути и возможности экспериментального изучения коры больших полушарий, играющих ключевую роль в сложных процессах психической деятельности. Основными процессами, динамично сменяющими друг друга в центральной нервной системе, являются процессы возбуждения и торможения. В зависимости от их соотношения, силы и локализации строятся управляющие влияния коры. Функциональной единицей высшей нервной деятельности является условный рефлекс. У человека кора больших полушарий головного мозга выполняет роль «распорядителя и распределителя» всех жизненных функции (И. П. Павлов). Это обусловлено тем, что в ходе филогенетического развития происходит процесс кортикализации функций. Он выражается во все большем подчинении соматических и вегетативных отправлений организма регуляторным влияниям коры мозга. В случае гибели нервных клеток в значительной части коры головного мозга человек оказывается нежизнеспособным и быстро погибает при заметном нарушении гомеостаза важнейших вегетативных функций. Учение о высшей нервной деятельности — одно из величайших достижений современного естествознания: оно положило начало новой эпохе в развитии физиологии; имеет большое значение для медицины, так как полученные в эксперименте результаты послужили отправным пунктом физиологического анализа и патогенетического лечения (например, сном) некоторых заболеваний центральной нервной системы человека; для психологии, педагогики, кибернетики, бионики, научной организации труда и многих других отраслей практической деятельности человека. Классификация условных рефлексов Условные рефлексы — это индивидуально приобретённые сложные приспособительные реакции организма животных и человека, возникающие при определённых условиях на основе образования временной связи между условным (сигнальным) раздражителем и подкрепляющим этот раздражитель безусловнорефлекторным актом. Осуществляются высшими отделами центральной нервной системы – корой головного мозга и подкорковыми образованиями; формируются в процессе онтогенеза на базе безусловных рефлексов. Термин «Условный рефлекс» предложен в 1903 г. И. П. Павловым. Исследование этого явления привело Павлова к созданию условнорефлекторной теории поведения животных и человека и нового учения о функциях мозга – физиологии высшей нервной деятельности. Изучение закономерностей образования и особенностей условных рефлексов способствует объективному познанию работы головного мозга. Существует множество методик исследования условных рефлексов, но наиболее известная из них методика слюнных пищевых условных рефлексов, она даёт возможность просто и точно оценивать их по мере выработки. И хотя современные электрофизиологические, нейрохимические, психофармакологические и др. методы анализа деятельности головного мозга внесли много нового в развитие условнорефлекторной теории, основные положения, сформулированные И.П. Павловым на основе изучения слюнных условных рефлексов, остаются незыблемыми поныне и служат фундаментом для новых исследований. Внутреннее торможение, формирующееся в элементах самой условной связи, лежит в основе разделения всех условных рефлексов на положительные и отрицательные. При положительных (подкрепляемых) условных рефлексах условный сигнал вызывает возбуждение и определённую деятельность организма (например, пищевую), при отрицательных (неподкрепляемых) угнетает её вследствие развития внутреннего торможения. В зависимости от раздражителя, на который вырабатывается рефлекс, различают натуральные и искусственные условные рефлексы. Натуральные условные рефлексы вырабатываются на естественные свойства безусловного подкрепления (такие, например, как вид, запах пищи), имеющие биологическую значимость для животного. Искусственные условные рефлексы вырабатываются на раздражители, первоначально не связанные с подкреплением (например, звонок, свет, метроном). В соответствии с биологическим значением безусловного подкрепления различают условные рефлексы пищевые, связанные с добыванием, приёмом и усвоением пищи; защитные (оборонительные) и др. По особенностям ответных реакций условные рефлексы делят на вегетативные и соматодвигательные. В зависимости от структуры условных раздражителей и от соотношений во времени действия условного и безусловного компонентов, а также от особенностей подкрепления, от времени ответной реакции на сигнал различают условные рефлексы: 1) первого порядка, образующиеся на базе безусловных; 2) высшего порядка (2-го, 3-го и т.д.), возникающие на основе ранее выработанных временных связей; 3) подражательные, при которых подкреплением служат поведенческие реакции другого животного; 4) ассоциации, когда условный рефлекс появляется при сочетании двух индифферентных раздражителей; 5) инструментальные, выполняя которые, животное содействует активному получению пищи или избавляет себя от вредных воздействий (например, болевых). При данной форме условного рефлекса ответ на сигнал не воспроизводит реакцию, на базе которой он был выработан. Для формирования условных рефлексов требуется достаточно высокий уровень организации центральной нервной системы. Так, для беспозвоночных характерны индивидуально приобретённые формы поведения, не отождествляемые с пассивное (реактивное) научение; оперантное научение; научение с помощью наблюдения; инсайт. 1.) Пассивное (реактивное) научение имеет место во всех случаях, когда организм пассивно (не прилагая целенаправленных усилий) реагирует на какие-то внешние факторы и когда в нервной системе формируются новые следы памяти. Пассивным научение являются следующие формы: — Привыкание – угасание ориентировочной реакции (рефлекса-«что такое ?» по И.П.Павлову). Если раздражитель многократно повторяется и не имеет особого значения для организма, организм перестает на него реагировать, развивается привыкание. Ориентировочная реакция угасает. — Сенсибилизация – усиление реакции организма на повторяющийся стимул, если он вызывает каждый раз неприятные ощущения. В данном случае научение носит негативный характер и выражается в соответствующих поведенческих реакциях типа стимул-ответ (после нескольких повторении действия раздражителя). — Импринтинг – запечатление в памяти новорожденного окружающей действительности. Импринтинг – особая форма ассоциативного научения, основанная на врожденной предрасположенности к определенным сочетаниям раздражителей и возникающих ответных реакциях в ранний период развития организма. — Классические условные рефлексы по И.П. Павлову – положительные или отрицательные. 2.) Оперативное научение – это научение, в ходе которого организм добивается полезного результата с помощью активного поведения. Имеются три основных подобных вида научения. — Инструментальный условный рефлекс – научение действию с помощью вознаграждения (подкрепления) — Метод проб и ошибок. — Самораздражение структур мозга для получения удовольствия. 3.) Научение путем наблюдения. Различают два вида подобного научения: простое подражание и викарное научение. — простое подражание. Например, обезьяна в общении с исследователями научилась мыть банан перед едой, не понимая, зачем это делает. — викарное научение. Осуществляется также посредством наблюдения, но при этом результат действия оценивается. Такое научение свойственно только человеку. Особенно часто используют научение путем наблюдения дети, причем в раннем онтогенезе оно является преимущественно подражательным. С возрастом викарное научение начинает все больше превалировать над подражательным научением. 4.) Научение путем инсайта (озарения) – внезапное нестандартное правильное решение задачи: иногда после отдельных проб и ошибок возникает идея результативного действия, которое может совершенствоваться в процессе достижения цели. Этот вид научения является следствием объединения опыта, накопленного в памяти, с той информацией, которой располагает индивидуум при решении проблемы. Следует заметить, что в конкретных ситуациях для достижения того или иного полезного приспособительного результата индивидуум чаще всего реализует не один, а несколько видов научения. Частное научение (обучение игре на музыкальном инструменте, обучение работе на компьютере и т.д.) по своей структуре всегда является комплексным. 5. Стадии поведенческого акта Любой психический и физиологический процесс человека связан с образованием функциональных систем и является основой поведенческих актов. Всякое желание человека обусловлено потребностями (примитивные, биологические, витальные, идеальные, социальные). Это определяется мотивационным возбуждением. Согласно П.К.Анохину, физиологическая архитектура поведенческого акта строится из последовательно сменяющих друг друга следующих стадий: афферентного синтеза, принятия решения, акцептора результатов действия, эфферентного синтеза (или программы действия), формирования самого действия и оценки достигнутого результата. 1. Поведенческий акт любой степени сложности начинается со стадии афферентного синтеза. Возбуждение в центральной нервной системе, вызвано внешним стимулом, действует не изолированно. Оно непременно вступает в тонкое взаимодействие с другими афферентными возбуждениями, имеющими другой функциональный смысл. Головной мозг производит обширный синтез всех тех сигналов внешнего мира, которые поступают в мозг по многочисленным сенсорным каналам. И только в результате синтеза этих афферентных возбуждений создаются условия для осуществления определенного целенаправленного поведения. Какое будет осуществляться поведение, зависит от того, какие процессы разовьются во время стадии афферентного синтеза. Содержание же афферентного синтеза в свою очередь определяется влиянием нескольких факторов: мотивационного возбуждения, памяти, обстановочной афферентации, пусковой афферентации. Мотивационное возбуждение появляется в центральной нервной системе с возникновением человека какой-либо потребности. Оно является необходимым компонентом любого поведения, которое всегда направлено на удовлетворение доминирующей потребности (витальной, социальной, идеальной). Мотивационное возбуждение играет особую роль в форматировании афферентного синтеза. Любая информация, поступающая в центральную нервную систему, соотносится с доминирующим в данный момент мотивационным возбуждением, которое является как бы фильтром, отбирающим нужное и отбрасывающим не нужное для данной мотивационной установки. Нейрофизиологической основой мотивационного возбуждения является избирательная активация различных нервных структур, создаваемая прежде всего лимбической и ретикулярной системами мозга. Это дает возможность мозгу изучить окружающую обстановку и выбрать момент для осуществления реакции. Завершение стадии афферентного синтеза сопровождается переходом в стадию принятия решения, которая и определяет тип и направленность поведения. 2.Стадия принятия решения — реализуется через специальную и очень важную стадию поведенческого акта – формирования аппарата акцептора результата действия. Это аппарат, программирующий результаты будущих событий. В нем актуализирована врожденная и индивидуальная память животного и человека в отношении свойств внешних объектов, способных удовлетворить возникшую потребность, а так же способов действия, направленных на достижение результата. 3. Акцептор результата действия. Она представлена сетью вставочных нейронов охваченных кольцевым взаимодействием. Возбуждение, попав в эту сеть, длительное время продолжает в ней циркулировать. Благодаря этому механизму и достигается продолжительное удержание цели как основного регулятора поведения. До того как целенаправленное поведение начнет осуществляться, развивается еще одна стадия поведенческого акта. 4. Стадия программы действия или эфферентного синтеза. На этой стадии осуществляется интеграция соматических и вегетативных возбуждений в целостный поведенческий акт. Эта стадия характеризуется тем, что действие уже сформировано как центральный процесс, но внешне оно еще не реализуется. 5. Формирование самого действия или выполнение программы поведения. Эфферентное возбуждение достигает исполнительных механизмов, и действие осуществляется. Благодаря аппарату акцептора результатов действия, в котором программируется цель и способы поведения, организм имеет возможность сравнивать их с поступающей афферентной информацией о результатах и параметрах совершаемого действия, т.е. с обратной афферентацией. Именно результаты сравнения определяют последующее построение поведения, либо оно корректируется, либо оно прекращается, как в случае достижения конечного результата. В случае, когда результаты действия не совпадают с акцепторами действия и возникает их рассогласование, появляется ориентировочно — исследовательская деятельность. В результате этого заново перестраивается весь афферентный синтез, принимается новое решение, создается новый акцептор результатов действия строится новая программа действий. Это происходит до тех пор, пока результаты поведения не станут соответствовать свойствам нового акцептора действия. И тогда поведенческий акт завершается последней санкционирующей стадией — удовлетворением потребностей. Таким образом, в концепции функциональной системы наиболее важным ключевым этапом, определяющим развитие поведения, является выделение цели поведения. Она представлена аппаратом акцептора результатов действия, который содержит два типа образов, регулирующих поведение – сами цели и способы их достижения. Выделение цели связывается с операцией принятия решений как заключительного этапа афферентного синтеза. 6. Особенности высшей нервной деятельности подростков (свойства нервной системы) Подростки обоего пола отличаются от взрослых более высокой возбудимостью нервной системы. У юношей снижение возбудимости до уровня взрослых мужчин происходит постепенно от 15 к 18 годам. У девушек в динамике этого свойства выявлены два критических периода: 16 лет, когда возбудимость резко повышается, и 19 лет, когда она вновь снижается почти до уровня взрослых женщин. Наибольшей возбудимостью характеризуются девушки 18-летнего возраста. Уровень силы нервной системы у подростков обоего пола ниже, чем у взрослых, а юноши всех возрастов отличаются от девушек более высокими показателями этого свойства. Повышение силы нервной системы до уровня взрослых у юношей происходит в 18 лет, а у девушек – в 19 лет. Наиболее слабая нервная система у 17-18-летних девушек. Подвижность нервных процессов (по показателям переработки зрительной информации) у подростков-юношей, включая и 18-летних, хуже, чем у взрослых мужчин; у подростков-девушек, напротив, лучше, чем у взрослых женщин. Возрастная динамика этого свойства у юношей протекает циклически, вследствие этого наихудшие показатели отмечаются в 16 лет. Возрастная динамика подвижности нервных процессов у девушек характеризуется постоянным снижением уровня от году к году. В 15-16 лет показатели подвижности у юношей и девушек одинаковы; начиная с 17 лет подвижность нервных процессов у мужчин существенно выше, чем у женщин. Подростки отличаются от взрослых и худшими показателями баланса нервных процессов, при этом показатели уравновешенности у юношей лучше, чем у девушек. У юношей всех возрастов прослеживается тенденция к преобладанию возбудительного процесса над тормозным; у девушек во всех возрастных периодах преобладает тормозной

Высшая нервная деятельность

Высшая нервная деятельность

Определение 1

Высшая нервная система – это работа коры больших полушарий и всех подкорковых образований.

Это понятие также включает в себя психологическую деятельность и особенности поведения индивида.

Поскольку каждому человеку свойственны свои отличительные способности, взгляды, привычки, убеждения и особенности поведения, которые формируются на протяжении всей жизни. Все эти особенности зависят от системы условных рефлексов, которые, в свою очередь, формируются под воздействием окружающей среды и наследственности нервной системы.

Свойства высшей нервной деятельности

К свойствам высшей нервной деятельности относят:

• Подвижность;
• Уравновешенность;
• Силу нервных процессов.

Самое важное свойство считается сила нервных процессов, которое характеризуется, непосредственно, способностью нервной системы выдерживать длительное время воздействие возбуждающих факторов.

Нервная система у людей бывает сильной, а бывает слабой. Сильная нервная система подразделяется на уравновешенную и неуравновешенную. Уравновешенность имеет высокую скорость при выработки условных рефлексов.

Подвижность зависит от смены процессов торможения и возбуждения. Люди с подвижной нервной системой легко переключаются с одной деятельности на другую.

Типы высшей нервной деятельности

Поведенческие реакции и психические процессы имеют свои индивидуальные особенности у каждого человека. Сочетание уравновешенности, подвижности и силы характеризует тип высшей нервной деятельности. По таким характеристикам различают следующие типы:

1. Уравновешенный, подвижный и сильный;
2. Неуравновешенный и сильный;
3. Уравновешенный, инертный и сильный;
4. Слабый.

Также различают типы высшей нервной деятельности связанные с взаимодействием первой и второй сигнальной систем:

Готовые работы на аналогичную тему

1. Мыслительный;
2. Художественный;
3. Мыслительный и художественный.

Отличительные черты высшей нервной деятельности человека

Физиология высшей нервной деятельности способна развивать и воспитывать все необходимые обществу качества и свойства личности, не зависимо тот его темперамента.

Поведение и психические процессы усложняет наличие в человеке второй сигнальной системы. Также высшая нервная деятельность характеризуется наличием условно-рефлекторной деятельности, приобретаемой человеком в течение всей его жизни. У человека в отличие от животных появляется мыслительная деятельность, осознаются внутренние процессы жизни.

Высшая нервная деятельность людей имеет социальную природу. Речь, имеющаяся у людей, дает возможность абстрактно мыслить, что накладывает весомый отпечаток на деятельность и поведение людей.

Разнообразие высшей нервной деятельности людей имеет огромное практическое значение. Научно доказано, что заболевания центральной нервной системы, непосредственно, связаны с особенностями протекания нервных процессов.

Пример 1

Например, люди со слабым типом высшей нервной деятельности являются клиентами клиники неврозов. Многие болезни протекают с большей сложностью у людей со слабой нервной системой. При наличии у человека сильной нервной системы, болезни переносятся легче, и быстрее наступает выздоровление.

Также от индивидуальных особенностей высшей нервной деятельности зависит действие препаратов на человеческий организм, поэтому их учитывают при назначении лечения.

На поведение человека, кроме его темперамента, влияет условие их жизни в обществе. Тип высшей нервной деятельности и темперамент являются предпосылкой в развитии необходимых качеств личности.

Фактор транскрипции гомеодомена дрозофилы, Vnd, ассоциируется с множеством кофакторов, широко фосфорилируется и образует множественные комплексы у эмбрионов

Abstract

Vnd является двойным регулятором транскрипции, который необходим для формирования дорсально-вентрального паттерна Drosophil . Тем не менее, наше понимание биохимической основы его регулирующей активности ограничено. В соответствии со способностью Vnd подавлять экспрессию-мишень в эмбрионах, эндогенно экспрессируемый Vnd физически ассоциируется с корепрессором, Groucho, в клетках Drosophila Kc167.Vnd существует как единый комплекс в клетках Kc167 в отличие от эмбрионального Vnd, который образует множественные высокомолекулярные комплексы. В отличие от своего гомолога позвоночных, Nkx2.2, полноразмерный Vnd может связываться со своей мишенью в EMSA, указывая тем самым, что доступность кофактора может влиять на слабую регуляторную активность Vnd при временных трансфекциях. Мы идентифицируем белок типа HMG1, D1, и новый белок HLH, Olig, как новые белки, взаимодействующие с Vnd, используя анализы коиммунопреципитации. Более того, мы демонстрируем, что и D1, и Olig коэкспрессируются с Vnd во время эмбриогенеза Drosophila , что согласуется с биологической основой этого взаимодействия.Мы также предполагаем, что состояние фосфорилирования Vnd влияет на его способность взаимодействовать с кофакторами, потому что мы показали, что Vnd широко фосфорилируется у эмбрионов и что он может фосфорилироваться активированной киназой MAP in vitro . Эти результаты подчеркивают сложности Vnd-опосредованной регуляции.

1. Введение

Фактор транскрипции гомеодомена Drosophila , Vnd, является одним из основателей класса гомеодоменных белков Nk, который необходим и достаточен для определения судьбы вентральных клеток ЦНС у эмбрионов Drosophila [1,2 ]. Drosophila Нейробласты расположены в три столбца, вентральный, промежуточный и латеральный, при этом вентральные клетки соседствуют с каждой стороны вентральной средней линии. Идентичность вентральной колонки трансформируется в идентичность промежуточной колонки у мутантных эмбрионов vnd , тогда как эктопическая экспрессия Vnd вентрализует нейроэктодерму [1,2]. Оба анализа мутантов [1,3-5] и биохимические данные [6,7] показывают, что Vnd функционирует как двойной регулятор, способный как активировать, так и репрессировать экспрессию целевого гена.Vnd взаимодействует с корепрессором Groucho, подавляя экспрессию целевого гена. В то время как взаимодействие Vnd с белком HMG, Dichaete, способствует активации генов-мишеней [6,8]. Однако анализы котрансфекции показывают, что необходимы дополнительные неидентифицированные кофакторы, чтобы повторить устойчивые регуляторные эффекты Vnd, очевидные у эмбрионов.

В этом отчете мы дополнительно исследуем биохимическую основу способности Vnd функционировать в качестве двойного регулятора. Мы идентифицируем клетки Drosophila Kc167 как эндогенный источник Vnd и показываем, что корепрессор, Groucho, физически взаимодействует с Vnd в этих клетках.Мы показываем, что Vnd существует как комплекс как в клетках Kc167, так и во множестве высокомолекулярных комплексов у эмбрионов. Мы устраняем связывание целевой ДНК как узкое место в неспособности Vnd оказывать устойчивые регуляторные эффекты в клетках культуры ткани, поскольку полноразмерные Vnd либо от временных трансфекций, либо от бактерий могут связывать свою мишень в анализах EMSA. Эти наблюдения подтверждают, что состояние фосфорилирования Vnd может влиять на Vnd-опосредованную регуляцию. Мы демонстрируем, что Vnd существует в виде множества изоформ у эмбрионов, и что фосфорилирование вносит вклад в это разнообразие.Мы также подтверждаем, что белок AT-hook, D1, физически взаимодействует с Vnd, и показываем, что D1 коэкспрессируется с Vnd у эмбрионов. Кроме того, мы показали, что подобно своему гомологу позвоночных, Nkx2.2, Vnd физически взаимодействует с уникальным гомологом Drosophila Olig, и что Vnd и Olig коэкспрессируются по крайней мере в одном нейробласте и во многих потомках нейробластов. Обсуждается значение этих результатов.

2. Результаты

Это исследование было вызвано предыдущими выводами о том, что временно экспрессируемый Vnd относительно инертен как в клетках Drospohila S2, так и в клетках Hek 293 позвоночных [6,7], несмотря на использование энхансеров, которые регулируются активностью Vnd в эмбрионах [ 9,10] для мониторинга регуляторной деятельности.Коэкспрессия ко-регуляторов Groucho и Dichaete, которые оба физически взаимодействуют с Vnd, также генерировала только слабые считывания [6], несмотря на тот факт, что оба этих ко-регулятора модулируют активность Vnd в эмбрионах Drosophila [3,11 ]. Т.о., неидентифицированные кофакторы, в дополнение к ко-регуляторам, идентифицированным до сих пор, по-видимому, необходимы для Vnd, чтобы оказывать устойчивые регуляторные эффекты, очевидные в развитии ЦНС Drosophila . Здесь мы исследуем природу этих сопутствующих факторов.

2.1 Клетки Drosophila Kc167 коэкспрессируют Vnd и Groucho

. В попытке идентифицировать легко доступный источник Vnd для биохимических анализов мы проверили ряд различных клеточных линий на эндогенную экспрессию Vnd с использованием анализов иммунопреципитации (данные не показаны). Используя наши антитела к Vnd для иммунопреципитации, мы идентифицировали клеток Drosophila Kc167 как эндогенный источник Vnd. Трансфекция клеток Kc167 люциферазным репортером, управляемым либо энхансером 3 ‘ ind , с помощью которого Vnd репрессирует экспрессию ind в эмбрионах [10], либо энхансером 5′ vnd , через который Vnd опосредует аутоактивацию [12]. при репрессии обоих репортеров (данные не показаны), предполагая, что эти клетки, вероятно, совместно экспрессируют факторы, которые необходимы для Vnd-опосредованной репрессии, но не для активации.Ассоциация Vnd с корепрессором, Groucho, обеспечивает репрессорную способность Vnd у эмбрионов [8]. Таким образом, мы спросили, взаимодействует ли Vnd физически с этим белком в клетках Kc167, определяя, может ли эндогенный Vnd вытягивать Groucho из этих клеток. показывает, что иммунопреципитированный Vnd разрушает эндогенный Groucho, что предполагает, что Vnd в клетках Kc167 может быть хорошим источником Vnd для дальнейших биохимических анализов.

Эндогенный Vnd в клетках Drosophila Kc167, ассоциированных с корепрессором, Groucho

Иммунопреципитация, выполняемая с использованием антитела против Vnd (дорожки 2 и 4) или сыворотки (дорожки 1 и 3), подвергали Вестерн-блоттингу и инкубировали с антитело против Vnd (дорожки 1 и 2) или антитело против Граучо (Gro) (дорожки 3 и 4).Иммунопреципитированный Vnd (дорожка 2) сбивает Gro (дорожка 4). Таким образом, эндогенный Vnd физически связывается с этим корепрессором в клетках Kc167.

2.2. Vnd образует высокомолекулярные комплексы в клетках Kc и в эмбрионах

. Для дальнейшего изучения этой возможности мы сравнили физическое состояние Vnd в клетках Kc167 с его состоянием в эмбрионах, определяя, как оба источника Vnd фракционируют на градиентах сахарозы. Чтобы определить физическое распределение Vnd, ядерные фракции из клеток Kc167 и эмбриональных лизатов разделяли с помощью SDS-страницы, вестерн-блоттинга и инкубировали с Vnd-специфическим антителом [13] после центрифугирования в градиенте сахарозы 0-30%.Рекомбинантный полноразмерный Vnd с гистидиновой меткой фракционируется примерно при 77 кД на основании миграции меченых маркеров молекулярной массы, загруженных на параллельные градиенты сахарозы. Тогда как Vnd из клеток Kc167 фракционировали при приблизительно 230 кД (), что указывает на то, что Vnd существует в этих клетках как низкомолекулярный комплекс.

Vnd присутствует в клетках Kc167 и эмбрионах в виде высокомолекулярных комплексов

Top. Вестерн-блоттинг фракций градиента сахарозы, полученных из ядерных экстрактов клеток Drosophila Kc167 (верхняя панель) или эмбрионов UAS-Vnd X Kruppel Gal4 (нижняя панель), инкубированных с антителом Vnd.Vnd из клеток Kc167 фракционируется в градиенте 0-30% сахарозы при приблизительно 230 кДа, тогда как Vnd из эмбрионов генерирует по меньшей мере 4 высокомолекулярных комплекса 250, 300, 600 и более 800 кДа. Стрелки указывают расположение рекомбинантного Vnd (77 кДа), лактозодегидрогеназы (140 кДа), каталазы (232 кДа) и ферритина (440 кДа), которые фракционировали одновременно в параллельных градиентах. Нижний. Показания денситометра блотов показаны выше.

Чтобы изучить, как Vnd физически отделяется от эмбрионов, уровни Vnd были увеличены за счет сверхэкспрессии с использованием системы UAS-Gal4 [14] под контролем энхансера Scabrous.Этот драйвер управляет сверхэкспрессией во всех нейроэктодермальных клетках, начиная со стадии 10 и далее. Эмбриональный Vnd генерирует ряд независимых пиков с высокой молекулярной массой () на градиентах сахарозы, это указывает на то, что Vnd присутствует во множестве комплексов у эмбрионов, что совпадает с разнообразными ролями Vnd в развитии ЦНС [13] [2]. Т.о., хотя клетки Kc167 коэкспрессируют Vnd и Groucho, они лишь частично имитируют микроокружение Vnd у эмбрионов. Таким образом, мы не рассматривали их как идеальный источник для дальнейшего биохимического анализа Vnd.

2.3. Vnd широко фосфорилируется у эмбрионов и может фосфорилироваться in vitro с помощью активированной MAP-киназы

Неопубликованные эксперименты по конкуренции временной трансфекции для определения основы селективного взаимодействия Vnd с Dichaete или Groucho [6] указывают на то, что когда Vnd связывается с Dichaete , добавление Граучо не вытесняет Дичете, и наоборот (данные не показаны). Так как активность Vnd модулируется с помощью передачи сигналов EGF [11,15], а активированная киназа MAP совместно локализуется с Vnd у эмбрионов [15,16], фосфорилирование Vnd, вероятно, играет важную роль в качестве двойного регулятора.Однако до настоящего времени вопрос о том, модифицируется ли Vnd посттрансляционно или является мишенью для активированной MAP-киназы, напрямую не решался. Vnd имеет пять сайтов-кандидатов фосфорилирования MAP-киназы: ³² PASP, ⁴³ PSSPATP, ¹⁵⁷ PWSP и ⁴¹⁹ PASP, которые соответствуют консенсусному сайту фосфорилирования PXS / TP [17]. Более того, необходимый пролин и серин / треонин сохраняются между Drosophila (D) melanogaster и D. virilis ().Таким образом, посттрансляционная модификация Vnd может модулировать дифференциальное сродство этого фактора транскрипции к эмбриональным кофакторам, которые одновременно коэкспрессируются с Vnd, и модулировать способность Vnd функционировать как активатор или репрессор.

Vnd широко фосфорилируется в эмбрионах и может фосфорилироваться активированной MAP-киназой in vitro.

A. Вестерн-блоттинг двумерных гелей иммунопреципитации Vnd из эмбрионов Drosophila , обнаруженных с использованием антитела к Vnd.Выборка была разделена; левый не был обработан, а правый — обработан щелочной фосфатазой. Присутствие множества реактивных пятен Vnd указывает на то, что Vnd сильно посттрансляционно модифицируется у эмбрионов (левая панель). Образец, обработанный фосфатазой, справа, имеет значительно меньше полос, что указывает на то, что фосфорилирование способствует множественным изоформам Vnd. Маркеры молекулярной массы как в. Обратите внимание на полосу прибл. 50 кДа представляют собой изоформы тяжелой цепи IgG.

B. Схема D. melanogaster Vnd, показывающая расположение пяти сайтов-кандидатов фосфорилирования MAP-киназы (отмечены зеленым цветом, обозначены 1-5) в полноразмерном белке и N-концевом пептиде Vnd, используемом в C. Позиции домена Eh (черный), гомеодомена (красный) и прямоугольник Nk-2 (желтый) выделены. Кандидаты в сайты-мишени MAP-киназы Vnd из D. melanogaster и D. virilis увеличены. Обратите внимание, что основные остатки пролина (P) и серина (S) или треонина (T) сохранены.

C. Верх. SDS-PAGE для Vnd (дорожки 1-5), используемого в качестве субстрата для фосфорилирования in vitro, а также в качестве отрицательного (дорожка 6) и положительного (дорожка 7) контролей.

Внизу. На авторадиограмме динамики фосфорилирования in vitro использовалась активированная MAP-киназа, показывающая увеличение включения P ³² в Vnd с увеличением времени. Отрицательный контроль не фосфорилируется, тогда как положительный контроль, PHAS-1, включает значительные количества P ³² через 30 минут.

Чтобы непосредственно выяснить, модифицируется ли Vnd посттрансляционно у эмбрионов, мы иммунопреципитировали этот фактор транскрипции из эмбрионов Scabrous-Gal4 X UAS- vnd и подвергли иммунопреципитат двумерному гель-электрофорезу и Вестерн-анализу.Наше антитело к Vnd идентифицировало множественные изоформы Vnd (), которые, по крайней мере частично, являются следствием различных состояний фосфорилирования белка, поскольку обработка иммунопреципитата фосфатазой генерировала намного меньше изоформ Vnd (). Мы также рассмотрели, можно ли фосфорилировать Vnd in vitro с помощью MAP-киназы. Гист-меченный рекомбинантный пептид Vnd, включающий пять кандидатов-целевых участков киназы Map (), очищали от бактерий и анализировали в качестве субстрата фосфорилирования для активированной киназы MAP.Для этих экспериментов мы использовали гомолог Rolled позвоночных, киназу Drosophila MAP. Эти две киназы имеют идентичные активные центры, поэтому они должны фосфорилировать мишени с одинаковой специфичностью. Наши результаты показывают, что рекомбинантный Vnd фосфорилируется активированной MAP-киназой in vitro (). Таким образом, фосфорилирование Vnd, вероятно, играет роль в способности Vnd функционировать как двойной регулятор, потенциально влияя на его избирательное взаимодействие с кофакторами, которые опосредуют его противоположные регуляторные активности.

2.4 Полноразмерный Vnd может связывать свою цель в EMSA

Watada et al. [18] ранее сообщали, что Nkx2.2, мышиный гомолог Vnd, имеет карбоксильный концевой домен интерференции связывания ДНК, который необходимо удалить (или, возможно, инактивировать in vivo ) для эффективного распознавания мишени [18]. Если способность Vnd связывать ДНК-мишень регулируется аналогичным образом, это может объяснить, почему этот фактор транскрипции является таким неэффективным регулятором в клетках S2 и клетках Hek 293 [6,7].Ранее мы показали, что рекомбинантный гомеодомен Vnd связывает 3 сайта-мишени Vnd в энхансере ind , а сайты связывания Vnd были дополнительно локализованы с помощью футпринтинга [10]. Однако мы еще не определили, может ли полноразмерный Vnd связываться с целевой ДНК и влияет ли посттрансляционная модификация Vnd на способность Vnd связывать свою мишень.

Чтобы ответить на этот вопрос, мы выполнили анализы EMSA с использованием рекомбинантных полноразмерных Vnd или Vnd, которые временно экспрессировались в клетках Hek293 и, таким образом, потенциально посттрансляционно модифицировались.Мы использовали олигонуклеотид (олиго), который соответствует сайтам связывания в энхансере 3 ’ ind [10] (через который Vnd репрессирует экспрессию ind в эмбрионах) в качестве мишени (). Когда мы сравнивали связывание Vnd из лизатов временно трансфицированных клеток Hek293 с очищенным рекомбинантным полноразмерным Vnd, мы обнаружили, что Vnd из обоих источников вызывает сдвиги подвижности, что соответствует нашим предыдущим открытиям с использованием Vnd HD [10]. Таким образом, связывание Vnd с его мишенью вряд ли будет узким местом в неспособности Vnd надежно регулировать экспрессию мишени в клетках культуры ткани, испытанных до сих пор.Доступность необходимых кофакторов, необходимых для регуляции Vnd, потенциально является фактором, ограничивающим способность Vnd регулировать экспрессию целевого гена в клетках культуры ткани.

Полноразмерный Vnd может связываться со своей целью in vivo.

A. Олиго, используемый в B, соответствует цели Vnd в энхансере ind , который содержит 4 сайта связывания Vnd (подчеркнуты).

B. Дорожки 1-3: EMSA с использованием рекомбинантного полноразмерного Vnd. Дорожки 4-6: EMSA с использованием экстрактов клеток Hek 293. Дорожка 4 представляет собой клеточный экстракт, содержащий пустой вектор.Дорожка 5 представляет собой клеточный экстракт, содержащий Vnd. Дорожки 6 соответствуют дорожкам 5 с избытком немеченого зонда. Отрицательный контроль на дорожке 1 соответствует зонду без белка.

Инкубация рекомбинантного Vnd с меченым олиго вызывает сдвиг подвижности (дорожка 3), когда используются большие уровни. Обратите внимание, что дорожка 2 содержит в 5 раз меньше рекомбинантного белка, чем дорожка 3. Инкубация Vnd в клеточном экстракте также вызывает изменение подвижности (дорожка 5). Инкубация клеточного экстракта с избытком немеченого олиго препятствует связыванию с меченым олиго (дорожка 6).

2,5. Vnd физически ассоциируется с белком AT-hook, D1, и белком HLH, Olig

Поскольку неидентифицированные кофакторы, дополнительные к Dichaete и Groucho, вероятно, потребуются для способности Vnd либо активировать, либо репрессировать экспрессию целевого гена, мы далее исследовали другие сопутствующие факторы, которые могут повлиять на регулирующую деятельность Vnd. Мы выбрали два белка, D1 и Olig, в качестве кандидатов в ко-регуляторы Vnd. D1 был идентифицирован при скрининге взаимодействий 2-дрожжевых гибридов по всему геному как новый белок, взаимодействующий с Vnd [19].Однако это сообщаемое взаимодействие не было подтверждено с помощью более строгих анализов взаимодействия. Olig считался вторым, вероятно, взаимодействующим с Vnd белком, поскольку гомолог Vnd, Nkx2.2, как физически, так и генетически взаимодействует с белком HLH позвоночных, Olig2, чтобы влиять на спецификацию подтипа нервных / глиальных клеток [20-22]. Таким образом, мы предположили, что либо Drosophila, D1 и / или Olig могут связывать Vnd и влиять на его активность в качестве двойного регулятора.

Чтобы определить, может ли Vnd иммунопреципитировать любой из этих факторов транскрипции, мы временно экспрессировали Vnd с аминоконцевым доменом Gal4 в клетках Hek 293 (которые были выбраны из-за их высокой эффективности трансфекции) и иммунопреципитировали с использованием антитела Gal4.D1 и Olig также независимо экспрессировались, и клеточные лизаты, содержащие любой фактор, инкубировали с иммунопреципитатом Vnd. Для экспрессии D1 и Olig оба кандидатных кофактора были клонированы в вектор экспрессии, несущий аминоконцевую метку Flag (подробности см. В разделе «Методы и материалы»). В качестве положительного контроля Dichaete, экспрессируемый с помощью Flag tag, и Groucho с Myc tag также были протестированы на взаимодействие с Vnd, поскольку ранее мы продемонстрировали, что Vnd может иммунопреципитировать оба этих ко-регулятора [6].

Иммунопреципитат Vnd разделяли и инкубировали с лизатами либо нетрансфицированных клеток, либо клеток, которые временно экспрессируют помеченные флагом D1, Olig или Dichaete, или меченую Myc Groucho. Затем соосаждения разделяли по размеру с помощью SDS-page и вестерн-блоттинга. Чтобы определить, какие белки Vnd могут разрушать, блоты инкубировали либо с антителом против Flag, либо с антителом против Myc tag. Здесь мы показываем, что Vnd физически ассоциируется не только с помеченным Myc Groucho и помеченным флагом Dichaete, но также с помеченным флагом D1 и помеченным флагом Olig ().Таким образом, эти анализы коиммунопреципитации подтверждают, что Vnd физически взаимодействует с белком AT-hook, D1, и идентифицируют уникальный белок HLH, Olig, как новый белок, который физически ассоциируется с этим фактором транскрипции.

Два новых белка, взаимодействующих с Vnd: D1 и Olig

Вестерн-блоттинг иммунопреципитатов, инкубированных с антителом против Gal4, которое выявляет Vnd с тегом ДНК-связывающего домена Gal4 или только с ДНК-связывающим доменом Gal4 (DBD) (A), анти-Flag , который обнаруживает помеченный флагом D1, Dichaete или anti-Myc, который обнаруживает Myc-tagged-Groucho (B).Интересующие полосы выделены стрелками.

Дорожка 1: Gal4-DBD + Olig

Дорожка 2: Gal4-DBD-Vnd + Olig

Дорожка 3: Gal4-DBD + D1

Дорожка 4: Gal4-DBD-Vnd + D1

Дорожка 5: Gal4 -DBD + Dichaete

Дорожка 6: Gal4-DBD-Vnd + Dichaete

Дорожка 7: Gal4-DBD + Groucho

Дорожка 8: Gal4-DBD-Vnd + Groucho

B. DBD Gal4 не взаимодействует ни с одним из них. антитело, указывающее на отсутствие неспецифического связывания. Напротив, присутствие Vnd приводит к тому, что Olig (дорожка 2) и D1 (дорожка 4) опускаются.Как сообщалось ранее, Dichaete (дорожка 6) и Граучо (дорожка 8) также снесены Vnd.

2.6 Экспрессия Drosophila olig и D1 перекрывается с доменом экспрессии Vnd пространственно-временным ограничением

Если физические взаимодействия между Vnd и кандидатными сорегуляторами, Olig и D1, релевантны in vivo , мы ожидаем, что обнаруживают, что Vnd коэкспрессируется с каждым из этих генов по крайней мере в подмножестве клеток. Vnd экспрессируется в эмбриональной нервной системе на протяжении эмбриогенеза сначала в вентральных нейроэктодермальных клетках (и), затем в большинстве вентральных нейробластов и задних промежуточных нейробластах (), а позже во многих нейронах ЦНС ().Поскольку паттерны экспрессии для олиг и D1 ранее не были описаны, мы выполнили гибридизацию in situ для определения паттернов экспрессии каждого из этих генов. Результаты этих экспериментов показаны на и.

Vnd локализуется совместно с олигом в субнаборе клеток ЦНС Drosophila

Передняя часть находится вверху, все виды вентральные. A-E) Экспрессия белка Vnd. Эмбрионы на панелях от A до E относятся к стадиям 10, 11, 12, 14 и 15 соответственно.F-J) Паттерн экспрессии мРНК олиг . Эмбрионы на панелях с F по J относятся к стадиям 10, 11, 12, 14 и 15 соответственно. K. Engrailed белок, который разделяет нейробласты заднего компартмента (коричневый) и олиг мРНК (фиолетовый). Пунктирная линия указывает среднюю линию. Выделены нейробласты MP2 и 7.1. L-N) белок Vnd (коричневый) и олиг мРНК (фиолетовый). L) Стадия 10, указаны вентральный (V), промежуточный (I) и латеральный (L) нейробласты. M) Стадия 11. N) Стадия 12.

D1 широко экспрессируется в эмбриональной ЦНС и коэкспрессируется с Vnd в подмножестве клеток.

Anterior вверх, все виды вентральные, кроме A, который является вентролатеральным.А) Распределение Vnd в эмбрионе дикого типа на стадии 5. B-F) Эмбрионы дикого типа, помеченные для экспрессии мРНК D1, вентральная средняя линия показана белым. Б) D1 изначально обнаруживается повсеместно из-за материнского вклада; более позднее сообщение ограничено ЦНС. Б) Этап 5. В) Этап 11; на вставке схематически показаны нейробласты, экспрессирующие Vnd, в вентральных (V) и промежуточных (I), но не латеральных (L) нейробластах. D) Этап 12. E) Этап 14. F) Этап 15. G-J) Белок Vnd (коричневый) и мРНК D1 (фиолетовый). G) У эмбрионов стадии 5 все клетки, экспрессирующие Vnd, коэкспрессируют D1, который встречается повсеместно (см. B) (H-J).После стадии 11 подмножество D1-положительных клеток также экспрессирует Vnd. F) Стадия 11. G) Стадия 12 эмбриона. H) Нервный шнур 14 стадии.

Мы обнаружили, что олиг мРНК первоначально обнаруживается на поздней стадии десять в нейробластах с одной / двумя вентральными столбиками на полусегмент, первоначально в MP2 (), (). На стадии 11 олиг- транскриптов обнаруживаются в вентральных нейробластах, передних промежуточных нейробластах и ​​материнских клетках ганглиев (GMC) (). На протяжении оставшейся части эмбриогенеза большинство клеток ЦНС экспрессируют сообщение olig ().Таким образом, Vnd коэкспрессируется с Olig в подмножестве клеток ЦНС, что позволяет предположить, что обнаруженное нами физическое взаимодействие является биологически значимым.

Затем мы исследовали распределение мРНК D1 . Первоначально мы обнаруживаем повсеместное сообщение D1 из-за материнского вклада (). Мы обнаружили, что на стадиях 5-8 эмбрионов, дважды меченных для белка Vnd и мРНК D1 , все клетки, которые экспрессируют Vnd, также экспрессируют D1 (например,). Это связано с тем, что на этих этапах разработки сообщение D1 распространяется повсеместно.Начиная со стадии 11 развития, мы обнаруживаем зарождающуюся транскрипцию сообщения D1 в ЦНС эмбриона. В самом деле, сообщение D1 обнаруживается исключительно в ЦНС в широком паттерне, который включает большинство, если не все, клетки нервной системы до конца эмбриогенеза (). Начиная со стадии 11 и далее подмножество клеток, экспрессирующих D1 , также экспрессирует Vnd (). Таким образом, D1 и Olig не только способны физически взаимодействовать с Vnd, но каждый из этих генов также коэкспрессируется с Vnd в развивающейся нервной системе эмбриона.Эти наблюдения подтверждают нашу гипотезу, что избирательное физическое взаимодействие этих белков с Vnd влияет на способность Vnd регулировать экспрессию генов-мишеней.

3. Обсуждение

Здесь мы используем биохимический подход для дальнейшего выяснения тонкостей Vnd-опосредованной регуляции. Этот гомеодоменный белок обладает как активаторной, так и репрессорной активностью и важен для раннего формирования паттерна ЦНС у Drosophila . Мы показали, что клетки Drosophila Kc167 экспрессируют эндогенный Vnd и что Vnd ассоциирован с корепрессором, Groucho, в этих клетках.Фракционирование в градиенте сахарозы указывает на то, что Vnd в клетках Kc167 присутствует в виде комплекса более 200 кД, тогда как Vnd из эмбрионов существует в виде множественных высокомолекулярных комплексов размером более 200 кД. Мы показываем, что полноразмерный Vnd может связываться со своей мишенью в клетках тканевой культуры, где фактор транскрипции относительно инертен. Мы также показали, что Vnd в значительной степени посттрансляционно модифицируется у эмбрионов, частично из-за множественного фосфорилирования, и что Vnd является субстратом для активированной киназы MAP.Далее мы идентифицируем белок AT-hook, D1, и белок HLH, Olig, как белки, взаимодействующие с Vnd, которые совместно локализуются с этим фактором транскрипции в эмбрионах Drosophila . Эти результаты углубляют наше понимание множественных уровней регуляции Vnd у эмбрионов.

Наше наблюдение, что Vnd существует во множестве высокомолекулярных комплексов у эмбрионов, согласуется с нашими открытиями, что Vnd взаимодействует по крайней мере с четырьмя разными кофакторами, частично в рамках пространственно-временных ограниченных паттернов.К ним относятся вездесущий корепрессор Groucho и специфичные для ЦНС факторы транскрипции Dichaete [6], Olig и D1. Значение взаимодействия Vnd с корепрессором Groucho и коактиватором Dichaete было определено ранее [3,4,6,8,11]. Напротив, влияние взаимодействия Vnd либо с Olig, либо с D1 в настоящее время неизвестно. У позвоночных гомолог Olig, Olig2, играет критическую роль в спецификации как моторнейронов, так и олигодендроцитов. Olig2 экспрессируется на ранней стадии нейрогенеза в ограниченной области желудочковой зоны, которая дает начало олигодендроцитам, а затем мотонейронам и является критическим для спецификации обоих типов клеток [20-22].Напротив, экспрессия Drosophila Olig активируется относительно поздно, сначала в нейробластах MP2 и 7.1, а затем в большинстве клеток ЦНС. Интересно, что время активации Drosophila Olig примерно соответствует времени в развитии позвоночных, когда домены экспрессии Olig2 и Nkx2.2 переключаются из взаимоисключающих на перекрывающиеся. Т.о., разница в пространственно-временном распределении Olig по сравнению с его коллегами из позвоночных указывает на то, что функция Olig у Drosophila может отличаться от функции его коллег из позвоночных.Несмотря на это наблюдение, коэкспрессия Olig2 и Nkx2.2 эволюционно консервативна, поскольку Olig и Vnd также совместно экспрессируются в субпопуляции клеток ЦНС. В настоящее время значение этого наблюдения остается неопределенным, поскольку мутанты Olig в настоящее время недоступны.

Наша демонстрация того, что Vnd взаимодействует с D1, подтверждает предыдущие находки Giot et al., [19] и представляет возможность, что Vnd является частью транскрипционного аппарата, который нацелен на ремоделирующие комплексы хроматина в специфические локусы.D1, гомолог HMG1 Drosophila , содержит 10 АТ-крючков, которые связывают малую бороздку ДНК [23]. Этот ген подавляет пестролистность, что согласуется с его ролью в модификации структуры хроматина [24]. D1 также взаимодействует с граничными элементами, участвующими в изоляции гена, через свой кислый концевой карбоксильный хвост. В соответствии со своей потенциальной ролью в ремоделировании хроматина D1 также взаимодействует с SnR1, который, в свою очередь, взаимодействует с Brahma и Trithorax [19]. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для более полного изучения эффекта взаимодействия Vnd с D1.Наши данные по связыванию ДНК показывают, что полноразмерный Vnd может связываться со своими мишенями в энхансере ind , что предполагает, что для надежного считывания регуляторных данных требуются неидентифицированные кофакторы в дополнение к Groucho и Dichaete, которые модулируют архитектуру хроматина после связывания ДНК. Действительно, мы обнаружили, что белок-крючок AT, D1, также связывает энхансер ind (данные не показаны). D1 потенциально может связываться через CArG-бокс, с которым связывается HMG-1 (Y) [25], поскольку три из четырех сайтов связывания Vnd имеют ядро ​​CAAG, соответствующее этому домену.

Наши двухмерные анализы геля показывают, что Vnd сильно фосфорилирован. Диапазон изоформ Vnd, наблюдаемый в Вестерн-анализах, может быть обусловлен селективным фосфорилированием пяти консенсусных последовательностей-мишеней MAP-киназы Vnd, PXS / TP, в положениях 32, 43, 157 и 419 в белке. В самом деле, тот факт, что рекомбинантный Vnd фосфорилируется активированной киназой MAP, указывает на потенциальное функциональное значение этих сайтов. Состояние фосфорилирования многих других факторов транскрипции влияет на их регуляторную активность.Например, фосфорилирование гомеодоменного белка Antennapedia казеинкиназой II важно для его активности [26]. Сходным образом фосфорилирование MAP киназы двух факторов транскрипции Drosophila Ets, Pointed-P2 (PntP2) и Yan / Anterior open [27], влияет как на развитие глаз, так и на формирование дорсально-вентрального паттерна эмбрионов. PntP2, гомолог человеческого Ets-1, функционирует как активатор транскрипции при фосфорилировании MAP-киназой [27,28,29]. В то время как Yan, гомолог человеческого Tel1, репрессирует гены-мишени в отсутствие киназы MAP [30,31].И PntP2, и Yan содержат ДНК-связывающий домен Ets и конкурируют за доступ к промоторным областям общих нижестоящих транскрипционных мишеней [32]. После активации Ras и последующей стимуляции киназы MAP, Yan фосфорилируется и экспортируется из ядра, где, как полагают, он расщепляется [30,31]. Это приводит к дерепрессии транскрипционных мишеней и позволяет клеткам адекватно реагировать на исходный активирующий сигнал, опосредованный PntP2. В случае Vnd Skeath [16] ранее сообщал, что распределение активированной MAP киназы перекрывается с доменом экспрессии Vnd, а сверхэкспрессия лиганда Spitz приводит к эктопической экспрессии Vnd.Более того, Vnd автоматически активирует собственное выражение [8,9]. Эти комбинированные наблюдения предполагают, что Vnd д. Фосфорилироваться, чтобы взаимодействовать с ко-регуляторами, необходимыми для Vnd-опосредованной активации. Для более тщательного решения этой проблемы требуется дальнейшая работа.

Таким образом, представленные здесь данные выделяют несколько уровней, на которых регулируется активность Vnd. Эта очевидная сложность неудивительна, поскольку Vnd играет ключевую роль в раннем формировании паттерна ЦНС, функционируя как активатор, так и репрессор экспрессии целевого гена.Этот диапазон регуляторов потенциально влияет на селективность Vnd для регуляции целевого гена в динамически изменяющейся среде, гарантируя, что мишени соответствующим образом активируются или подавляются.

4. Методы и материалы

4.1 Иммунопреципитация Vnd из клеток Kc167

Клетки Kc167 поддерживали в среде Шнайдера (Gibco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллин / стрептомицин. Иммунопреципитацию проводили, как описано ранее [6], с использованием ядерных экстрактов, которые были приготовлены из клеток Kc167, как описано в [33].Клетки гомогенизировали (× 20 ходов) с помощью гомогенизатора Даунса типа A в 5 мл ледяного NB1 (10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 0,1% Triton X-100. , 0,1 М сахарозы). После центрифугирования при 200 g в течение 1 мин супернатант осторожно смешивали с равным объемом охлажденного NB2 (NB1 с 0,25 М сахарозой). 2,5 мл NB3 (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 0,33 М сахароза) наслаивали на суспензию клеток, и ядра осаждали при 1000 г при 4 ° C в течение 10 мин.Ядра ресуспендировали в буфере для иммунопреципитации (IP) [20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 10 мМ NaF, 1 мМ Na ₃ VPO ₄ , 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и коктейль ингибиторов протеаз (Roche), содержащий 0,5% Triton X-100] и кратковременно встряхивают. После предварительной инкубации с агарозой с протеином A / G PLUS (Santa Cruz Biotechnology) в течение 30 минут при 4 ° C ядерный лизат инкубировали с нашим кроличьим поликлональным антителом против Vnd, вращая в течение ночи при 4 ° C. Затем добавляли агарозу с белком A / G PLUS и лизат вращали при 4 ° C в течение 2 часов.Гранулы осаждали центрифугированием, трижды промывали IP-буфером, содержащим 0,1% Triton X-100, и ресуспендировали в буфере для образцов SDS – PAGE. Иммунопреципитаты разделяли электрофорезом в SDS-PAGE, переносили на мембрану Immobilon-P (Millipore) и проводили вестерн-блоттинг. Двойные блоты инкубировали с антителом против Vnd [1] для обнаружения Vnd или с мышиным антителом против Groucho (ядро гибридомы Университета Айовы) для обнаружения Groucho. Связывание конъюгированных с пероксидазой вторичных антител детектировали хемилюминесценцией с использованием набора Lightning (Perkin Elmer).

4.2 Сахарозное градиентное фракционирование Vnd из клеток Drosophila Kc167 и из эмбрионов Drosophila.

Ядра выделяли из клеток Kc167, как описано выше. В случае эмбрионов после сбора потомства мух pUAST -vnd X Scabrous Gal4 эмбрионы подвергали дехорионированию в хлороксе, промывали 0,7% NaCl, 0,1% тритона-X 100 и хранили при -80 ° C. Экстракты зародышевых ядер получали, как описано выше, с использованием 1 г эмбрионов в 50 мл буфера NB1. 25 мл NB3 наслаивали на суспензию клеток в буфере NB1 и NB2, и ядра осаждали при 1000 г при 4 ° C в течение 10 мин.Ядра лизировали в 1 мл буфера, состоящего из 50 мМ HEPES (Invitrogen), pH 7,5, 0,1% NP-40, 50 мМ NaCl, 200 [пропорционально] M Na ₃ VO ₄ , 50 мМ β-глицерина. фосфата, 50 мМ NaF (Sigma) и коктейль ингибиторов протеазы (Roche) и центрифугировали при 14000 g при 4 ° C в течение 15 мин. Затем супернатант загружали в 10 мл 0-30% непрерывного градиента сахарозы в буфере для лизиса. Стандарты с высоким молекулярным весом (Amersham Biosciences) и лизат бактериальных клеток, содержащий полноразмерный рекомбинантный Vnd (см. 4.6 для деталей) были разделены на отдельные, но идентичные градиенты. После центрифугирования в роторе SW41 при 35000 об / мин в течение 16 часов фракции 440 мкл были собраны с поверхности градиентов. Фракции осаждали метанолом и хлороформом согласно [34]. Осадки фракций растворяли в буфере для образцов Лэммли (Bio-Rad) для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Распределение Vnd определяли с использованием кроличьих антител против Vnd. Связывание конъюгированных с пероксидазой вторичных антител детектировали хемилюминесценцией с использованием набора Lightning (Perkin Elmer).

4.3 Иммунопреципитация Vnd из эмбрионов, 2-мерный гель-электрофорез и обработка фосфатазой

Vnd был иммунопреципитирован из ядер 1 г эмбрионов Scabrous -Gal4 X UAS- vnd , как описано выше. Половину образца обрабатывали щелочной фосфатазой; остаток не лечили. Двумерный гель-электрофорез выполняли в Мичиганском университете Protein Core. Распределение Vnd определяли с использованием кроличьих антител против Vnd.Хемилюминесценцию использовали для обнаружения с помощью набора Lightning (Perkin Elmer).

4.4 Фосфорилирование in vitro Vnd

Слитый белок Vnd, включающий 5 кандидатных сайтов-мишеней MAP-киназы, был очищен в денатурирующих условиях из вектора pRSet C (Invitrogen), содержащего фрагмент vnd размером 1,68 кб, который простирается от начала трансляции. сайт в первую спираль гомеодомена [35]. После ступенчатой ​​ренатурации в 10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ β-меркаптоэтанол, пептид подвергали фосфорилированию in vitro с использованием набора киназ MAP (Stratagene).PHAS-1 (Stratagene), субстрат из 117 аминокислот, который является высокоспецифичным для активированной киназы MAP, использовали в качестве положительного контроля. К каждой реакции добавляли 2 мкК гамма ³² АТФ. Реакции инкубировали при 30 ° C и останавливали добавлением буфера Лэммли. После отделения SDS-страниц гель сушили и экспонировали на пленке.

4.5 Выделение Drosophila virilis Vnd

Два перекрывающихся геномных клона D. virilis vnd были выделены из пользовательской геномной библиотеки после гибридизации при 55 ° C и отмывки в 2X SSC при 55 ° C.Фрагменты субклонировали в pBluescript и секвенировали в обоих направлениях в ядре секвенирования Мичиганского университета. Предполагаемые открытые рамки считывания были переведены и сопоставлены с D. melanogaster Vnd с использованием MACVECTOR.

4.6 Создание полноразмерного Vnd и EMSA

Продукт ПЦР, соответствующий полноразмерному vnd, был получен с использованием смысла 5 ‘GATAT ACTCGAGTACCACGTCGGCGTCCTTGGA 3’ и 5 ‘CTCGACGAATTCCT AGCAATATTAGGGCCACCAG 3’ и клонированных праймеров антисмыслового вектора p. (Invitrogen) с использованием синтетических сайтов EcoR1 и Xho1, включенных в праймеры.Полноразмерный Vnd очищали в денатурирующих условиях, как описано ранее, и диализовали в Z-буфере (10% глицерин, 12,5 мМ Hepes, pH 7,8, 6 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ DTT, 50 мМ KCl, 0,05% NP 40). Для генерации Vnd из клеток культуры ткани 100-миллиметровые планшеты Hek293, поддерживаемые в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллин / стрептомицин, трансфицировали 6 мкг вектора с использованием 18 мкл Fugene. 48 ч. после трансфекции ядерные лизаты получали, как описано выше, и подвергали диализу в Z-буфер.EMSA выполняли, как описано ранее в [11], за исключением того, что 100 нг ДНК спермы лосося использовали в качестве конкурента вместо poly dI-dC.

4.7 Анализ совместной иммунопреципитации

олиг был амплифицирован из Est Gh27679 с использованием следующих смысловых и антисмысловых праймеров: 5 ’GCTCGTGATATCTATGGATCCCTCGAATCTTGC 3’ и 5 ’GTGCATTCTAGATT AACTGCTGCTAGTCGhoTG с сайтами синтетических. D1 амплифицировали из Est RE39218 с использованием следующих смысловых и антисмысловых праймеров: 5 ’GCACTCGAAT TCGATGGAGGAAGTTGCGGTAAAGAAGC 3’ и GTCTCAGTCGACTAACCGTCGTT GGCATCATTTTCG 3 ’с синтетическими сайтами EcoR1 и Sal1.Затем продукты ПЦР были направленно клонированы в вектор pFlag (Sigma). Чашки (100 мм), содержащие клетки Hek 293, независимо трансфицировали 6 мкг каждого вектора. Иммунопреципитацию проводили, как описано в [6]. Лизаты клеток получали через 48 часов после трансфекции с использованием IP-буфера и коктейля ингибиторов протеиназ (Roche), содержащего 0,5% Triton X-100. Химеры домена связывания ДНК Gal4 Vnd осаждали из клеточных лизатов с использованием антитела, которое распознает домен связывания ДНК Gal4 (Santa Cruz Biotechnology), вращающегося в течение ночи при 4 ° C.После иммунопреципитации белка с использованием агарозы A / G PLUS (Santa Cruz Biotechnology) гранулы делили на аликвоты и инкубировали с равными количествами клеточного лизата, содержащего каждый из белков-кандидатов, взаимодействующих с Vnd. Коиммунопреципитаты вращали в течение 2 ч при 4 ° C, осаждали центрифугированием и трижды промывали IP-буфером, содержащим 0,1% Triton X-100, и проводили вестерн-блоттинг. Затем блоттинги в трех повторностях инкубировали с антителом против Myc (Sigma) для обнаружения меченного Myc Groucho, ant-Flag (Sigma) для обнаружения меченого Flag Dichaete, Olig и D1 или антитела, специфичного для Gal4 (Santa Cruz Biotechnology), для обнаружить химеру Gal4-Vnd.Связывание вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, детектировали с помощью хемилюминесценции с использованием набора Lightning (Perkin-Elmer).

4.7 Локализация гибридизации in situ D1 и Olig в эмбрионах дрозофилы относительно белка Vnd

EST для D1 и Olig (см. 4.6), полученные из DGRC, были использованы для создания меченных дигоксигенином антисмысловых РНК-зондов, как описано ранее. [35]. Двойные метки с антителом к ​​Vnd наносили последовательно, как описано в [35]; За гибридизацией in situ с антисмысловыми зондами сразу же следовала инкубация в кроличьих антителах против Vnd в концентрации 1: 200 [35].

Interactive Fly, Drosophila

vnd / NK2 — первый экспрессируемый нейральный ген. Он функционирует на ранней стадии развития нервной системы, образуя препаттерн, даже до того, как пронейральные гены начинают функционировать. Он необходим для формирования субнабора сегментарных нейробластов и, возможно, в качестве гена нейроэктодермальной фиксации. Транскрипция vnd находится выше пронейрального комплекса achaete-scute. Он отвечает за индукцию achaete и scute в подмножестве нейробластов.Он также регулирует гены энхансера расщепленного комплекса (Kramatschek, 1994).

Очевидно, что экспрессия гена E (spl) -C зависит от латерального ингибирования и пути Notch, действующего через супрессор безволосого. Роль VND в транскрипционной активации генов E (spl) -C в настоящее время неясна. Возможно, VND активирует пронейральные гены, которые, в свою очередь, активируют гены E (spl) -C. Физическое взаимодействие VND с E (spl) -C еще не проверено.

Специфичность функции нейрона в регуляции различных сегментарно повторяющихся групп мышц проистекает из установления паттерна дифференцировки нейронов в нейроэктодерме.Этот паттерн определяется комбинацией парных правил и генов полярности сегментов, первый из которых отвечает за сегментацию, а второй — за подразделение клеточных судеб внутри сегментов. Соответствующим образом названные гены дорсовентральной полярности устанавливают экспрессию генов вдоль оси DV. На восьмой стадии эмбрионального развития каждый вентральный полусегмент (левая или правая половина сегмента) подразделяется на три продольных столбца от вентральной средней линии: медиальный, промежуточный и латеральный.Они также разделены на передне-заднюю ось на ряды от A до D.

Экспрессия achaete-scute зависит от VND / NK2 в двух пронейральных кластерах медиального столбца, строках B и D, в то время как VND / NK2 практически не влияет на экспрессию генов в строках A и C и не оказывает никакого эффекта. на экспрессию генов в промежуточных и боковых столбцах. Таким образом, VND / NK2 требуется вдоль точных областей как передне-задней оси, так и дорсально-вентральной оси.Используя белки Snail или Hunchback в качестве маркеров, было показано, что медиальные нейробласты из рядов B и D не образуются у мутантов VND / NK1. Другие гены определяют оставшиеся нейробласты? На сегодняшний день эти регуляторы не идентифицированы (Skeath, 1994).

Предполагается, что гомеобокс мышечного сегмента функционирует аналогично vnd / NK2 в формировании нейронного паттерна, и что эти роли сохранены у насекомых и позвоночных. Взаимодействие между DPP и короткой гаструляцией (гомологи BMP и хордина позвоночных) ограничивают msh (гомологи позвоночных генов Msx) экспрессия в самом латеральном столбце пронейральных скоплений (у позвоночных самые латеральные части нервная пластинка).Аналогичным образом и ограничены медиальным столбцом пронейральных кластеров. В у позвоночных vnd гомолог Nkx-2 ограничен медиальной областью нервной пластинки. И мш, и vnd выполняют аналогичную консервативную функцию, регулируя экспрессию комплекса achaete-scute для отдельные нейробласты. Аналогичным образом Msx и Nkx-2 регулируют экспрессию позвоночных achaete-scute. гомолог (пепел) в развивающемся нервном столбе (D’Alessio, 1996).

Для анализа судьбы клеток ЦНС у эмбрионов, лишенных функции vnd ( эмбрионов vnd ), были использованы маркеры, которые специфически маркируют вентральную, промежуточная, или нейроэктодерма дорсального столба и нейробласты. Использовали три маркера вентральной колонны: Achaete, Odd-skipped (Нечетный) и Просперо. Ахеты маркируют нейроэктодерму и нейробласты вентральной и дорсальной колонок 3 и 7 рядов; Нечетные маркирует нейробласты вентрального и дорсального столбца в ряду 1, тогда как Просперо маркирует нейробласты вентрального столбца в ряду 3 (MP2).Использовали два промежуточных столбца-маркера: Ind и Huckebein. Дефект промежуточного нейробласта маркирует всю нейроэктодерму промежуточного столбца и нейробласты, тогда как Хакебейн маркирует промежуточную нейроэктодерму и нейробласты третьего ряда (например, NB 4-2), а также вентральную и промежуточную нейроэктодерму 1-го и 5-го рядов. Дорсальный маркер Msh маркирует всю нейроэктодерму и нейробласты дорсального столбца. Используя эти маркеры, было проведено исследование, чтобы определить, является ли vnd необходимым или достаточным для определения брюшной колонки. идентичность в развивающейся ЦНС.У vnd мутантные эмбрионы Achaete, Odd и Prospero не обнаруживаются в нейроэктодерме брюшного столба или нейробластах. Этот фенотип является результатом отсутствия экспрессии генов в нейроэктодерме и некоторых нейробластах, так как а также сбой в образовании нейробластов. Например, вентральный столбец NB 1-1 образует> 80% времени, но он никогда не бывает Odd +. Тем не мение, Отсутствие Просперо + MP2 является результатом сбоя в формировании MP2. Сделан вывод, что vnd необходимо для определения нейроэктодермы брюшного столба и идентичности нейробластов, а также для формирования специфических нейробласты вентральной колонны (McDonald, 1998).

Брюшной столб у эмбрионов vnd может быть полностью или частично трансформирован в другой столбчатая идентичность (промежуточная или дорсальная) или может принимать новую идентичность. Чтобы различать эти два Возможности, маркеры промежуточного и дорсального столбца были исследованы на эмбрионах vnd . У эмбрионов vnd маркеры промежуточного столбца эктопически экспрессируются в вентральном столбце. Ind — это обнаруживается как в вентральной, так и в промежуточной колонке нейроэктодермы и нейробластов, хотя из-за того, что некоторые вентральные нейробласты не образуются у эмбрионов vnd , нейробласты промежуточного столбца часто смещаются в более вентральное положение.Промежуточный маркер колонки Huckebein также обнаруживается как в брюшной, так и в нижней части тела. промежуточные столбцы нейроэктодермы 3 ряда и нейробластов (13% в вентральном столбце). Экспрессия Msh в нейроэктодерме дорсального столба и нейробластах нормальна у эмбрионов vnd . Кроме того, экспрессия дорсальной колонки Achaete и Odd не изменилась. Взятые вместе, эти данные показывают, что vnd необходимы для определения идентичности вентральной колонки. и подавление идентичности промежуточных столбцов в ЦНС (McDonald, 1998).

В ходе этого анализа экспрессии генов было замечено, что нейроэктодерма брюшного столба имеет характерный клеточная морфология. Клетки Vnd + вентральной колонки часто вытянуты вдоль оси DV, чтобы придать им вид коэффициент асимметрии равен или> 1,5 (длинная ось делится на короткую ось), тогда как ячейки промежуточного столбца Ind + больше часто круглые, с коэффициентом асимметрии, близким к 1,0. В эмбрионах и наибольшее количество клеток вентральной колонки не предполагают удлиненную морфологию, вместо этого демонстрируя круглую морфологию, характерную для клеток промежуточного столбца.Взятые вместе, этот молекулярный маркер и анализ морфологии клеток показывают, что vnd требуется для установления профили экспрессии генов вентральной колонки (возможно, путем прямой активации и / или репрессии транскрипции), а также вызывают изменение формы клеток, характерное для нейроэктодермы вентрального столба (McDonald, 1998).

Чтобы определить, достаточно ли vnd для определения судьбы вентральной колонки, был использован трансген hsp70- vnd для эктопического экспрессируют vnd в промежуточном и дорсальном столбцах нейроэктодермы.В эмбрионах, несущих трансген hsp70- vnd , который подвергается тепловому шоку для индукции повсеместной экспрессии vnd (эмбрионы hs- vnd ), вентральные маркеры эктопически экспрессируются в промежуточных и дорсальных столбах нейроэктодермы и нейробластов, а промежуточные и спинные маркеры потеряны. Однако трансформация судьбы промежуточных клеток в вентральную более сложна. полный, чем переход от дорсальной к вентральной клеточной судьбе. У эмбрионов hs- vnd маркер вентральной колонки Achaete расширяется в промежуточную колонку, ведущую к Achaete. экспрессия, непрерывно распространяющаяся через вентральный, промежуточный и дорсальный столбцы нейроэктодермы и нейробласты.Точно так же вентральные маркеры нейробластов Prospero и Odd также демонстрируют эктопические экспрессия в промежуточном столбце у эмбрионов hs- vnd . И наоборот, эмбрионы hs- vnd демонстрируют потеря выражения маркера промежуточного столбца. Промежуточный маркер столбца Ind сильно подавлен или полностью подавлен. отменены в эмбрионах hs- vnd . Промежуточный столбец, маркер Huckebein в строке 3 также подавлен. в эмбрионах hs- vnd ; Выражение Хакебейна в строке 5 не изменилось, что неудивительно, потому что как вентральный, так и промежуточный столбцы экспрессируют Huckebein в нейроэктодерме 5 ряда дикого типа.Эти результаты показывают, что ectopic vnd приводит к превращению промежуточного столбца в идентичность вентрального столбца как в нейроэктодерме, так и в типы клеток нейробластов (McDonald, 1998).

Дорсальный столбец неправильно указан у эмбрионов hs- vnd , но не полностью преобразован в идентичность вентрального столбца. В hs- vnd , маркер вентрального столбца Huckebein ряда 1 эктопически обнаруживается в дорсальной нейроэктодерме, а маркер дорсального столбца Msh частично репрессируется.Однако маркер брюшной колонки Prospero эктопически экспрессируется в промежуточной колонке, но не в дорсальной. столбец. Таким образом, эктопический vnd достаточен для частичного преобразования дорсальной колонки в брюшную. идентичность (Макдональд, 1998).

Чтобы определить степень, в которой Vnd контролирует идентичность нейробластов вентральной колонки, клон клеток нейробластов маркер Even-skipped (Eve) был использован для анализа развития специфических нейробластов вентральной и промежуточной колонки.канун маркирует потомство двух нейробластов вентральной колонки (нейроны aCC / pCC из NB 1-1; нейроны U / CQ из NB 7-1) и потомство одного промежуточного столбца нейробласта (нейроны RP2 / RP2sib из NB 4-2). Образец Евы — чувствительный индикатор нормальных клеточных судеб в этих клонах нейробластов. У эмбрионов vnd нейроны Eve + aCC / pCC и U / CQ, происходящие из нейробластов вентральной колонки, никогда не обнаруживаются. NB 1-1 формирует и производит GMC Prospero +, Eve; таким образом, потеря Eve из нейронов aCC / pCC вызывается изменением идентичности NB 1-1 или клеточного происхождения.В Напротив, отсутствие нейронов Eve + U / CQ является результатом неспособности их родительского NB 7-1 сформироваться. Кроме того, эмбрионы vnd демонстрируют частичную пенетрантную дупликацию нейронов Eve + RP2 / RP2sib, происходящих из промежуточных столбец NB 4-2. Этот фенотип является результатом трансформации нейробласта вентрального столбца Huckebein в дубликат Huckebein + промежуточный столбец NB 4-2 (McDonald, 1998).

Достаточно ли vnd для индукции клонов вентральных нейробластов в нейробластах промежуточного или дорсального столбца? В hs- vnd У эмбрионов развивается избыточное количество нейронов вентральной колонки Eve + aCC / pCC и U / CQ.Потому что hs- vnd вызывает промежуточные и вентральные трансформации идентичности нейробластов, вероятно, что избыток Нейроны aCC / pCC и U / CQ развиваются из дублированных нейробластов вентрального столбца (NB 1-1 и 7-1). Однако нельзя исключить возможность того, что эктопический vnd запускает дублирование идентичностей GMC или избыточные раунды деления клеток. Сделан вывод, что потеря vnd приводит к трансформации идентичности нейробластов вентрального столбца в промежуточный столбец, т.е. поддерживается в клеточном клоне по крайней мере трех нейробластов (NB 1-1, 7-1 и 4-2), а эктопический vnd приводит к обратная трансформация промежуточного звена в идентичность нейробластов вентральной колонки, которая поддерживается в клеточном клоне at минимум два нейробласта (NB 1-1 и 7-1) (McDonald, 1998).

Дефекты формирования нейробластов вентральной и промежуточной колонны встречаются у эмбрионов vnd . Там есть потеря нейробластов вентральной колонны, особенно MP2 и NB 7-1. Кроме того, в hs- vnd У эмбрионов в промежуточной колонке происходит преждевременное формирование нейробластов. У эмбрионов дикого типа промежуточные столбчатые нейробласты формируются на средней стадии 9, но у эмбрионов hs- vnd эти нейробласты формируются раньше, на ранняя стадия 9, примерно в то время, когда формируются нейробласты соседнего вентрального столба.Эти данные предоставляют дополнительные доказательства трансформации идентичности промежуточного звена в вентральный столбец (McDonald, 1998).

vnd также регулирует формирование дорсовентрального паттерна процедурной нейроэктодермы. vnd , msh и ind каждый экспрессируется в процедурной эктодерме: Vnd в вентральном домене, Ind в трех небольших кластерах клеток в промежуточных положениях и Msh в дорсальном домене. Есть два различия в гене экспрессия и регуляция в процедурной области по сравнению с грудной и брюшной нейроэктодермой: (1) Vnd и Msh разделяют обширную границу, прерываемую только двумя небольшими островками клеток Ind +.У эмбрионов ВНД , Мш расширяется в вентральный домен процедурной нейроэктодермы, показывая, что Vnd необходим для подавления мш выражение в голове. В соответствии с этим результатом неправильная экспрессия vnd приводит к репрессии msh . (2) кластер 1 передних клеток Ind +, по-видимому, коэкспрессирует Vnd; коэкспрессия Vnd и Ind никогда не наблюдается в грудной и брюшной нейроэктодерме. Удивительно, но эмбриона vnd демонстрируют потерю Ind + кластер 1, и неправильная экспрессия vnd не влияет на экспрессию Ind в кластере 1; таким образом, в этой области эмбриона Vnd необходим для развития кластера Ind + 1.Поскольку клетки Ind + кластера 1 в первую очередь ограничивается нейробластами, одна из возможностей состоит в том, что потеря vnd в нейроэктодерме приводит к отказу нейробластов. образование и, следовательно, к потере клеток Ind +, а не то, что Vnd непосредственно активирует транскрипцию и в этом домене. Остальные два кластера клеток Ind + (2 и 3) экспрессируются и регулируются способом, совместимым с грудным и торакальным отделами. брюшная нейроэктодерма. Оба кластера 2 и 3 клеток Ind + непосредственно примыкают к клеткам Vnd +, но не экспрессируют Vnd.В vnd , кластер 3 Ind + расширяется вентрально в домен, обычно экспрессирующий vnd , тогда как кластер Ind + 2 выглядит незатронутым. Неправильная экспрессия vnd подавляет экспрессию ind в кластерах 2 и 3. Таким образом, vnd может как активировать ind (кластер 1), так и репрессировать ind (кластеры 2 и 3), в зависимости от положения внутри процедурной зоны. нейроэктодерма (McDonald, 1998).

Роль en и новых взаимодействий между msh, ind и vnd в формировании дорсовентрального паттерна головного мозга дрозофилы и брюшного нервного канатика

Подразделение нейроэктодермы на отдельные домены экспрессии генов необходимо для правильной спецификации нервных стволовых клеток (нейробластов) во время развития центральной нервной системы.Это исследование расширяет знания о формировании дорсовентрального (DV) паттерна эмбрионального мозга Drosophila и раскрывает новые генетические взаимодействия, которые контролируют экспрессию эволюционно законсервированных генов гомеобокса дефектная вентральная нервная система ( vnd ), дефектных промежуточных нейробластов ( ind ) и мышечного сегмента homeobox ( msh ). Было показано, что перекрестная репрессия между Ind и Msh стабилизирует границу между промежуточным и дорсальным тритоцеребром и дейтоцеребром, и оба фактора транскрипции способны ингибировать экспрессию vnd .Напротив, сегмент Vnd специфически влияет на экспрессию и ; он репрессирует ind в тритоцеребруме, но положительно регулирует ind в дейтоцеребруме, подавляя Msh. Эти данные предоставляют дополнительные доказательства того, что в мозге, в отличие от ствола, точные границы между доменами экспрессии генов DV в значительной степени устанавливаются посредством взаимного ингибирования. Более того, было обнаружено, что ген полярности сегмента , зашитый ( и ), регулирует экспрессию vnd , ind и msh сегмент-специфическим образом.En репрессирует msh и ind , но поддерживает экспрессию vnd в дейтоцеребруме, требуется для подавления Msh в тритоцеребруме, чтобы позволить активацию ind , и необходимо для поддержания Ind в сегментах туловища. Эти результаты показывают, что вход от системы формирования переднезаднего паттерна необходим для пространственно ограниченной экспрессии генов DV в головном мозге и вентральном нервном канатике (Seibert, 2010).

Пространственный и временной порядок, в котором гены DV ( vnd , ind и msh ) активируются в нейромерах мозга, отличается от их появления в нейроэктодерме туловища, и эти различия, по-видимому, являются основными для сегмент-специфическая регуляция экспрессии vnd , ind и msh .В раннем трито- и дейтоцеребруме Vnd экспрессируется не только в вентральной, но также и в промежуточной нейроэктодерме, где перекрестная репрессия между Vnd и дорсально экспрессируемым Msh устанавливает границу между промежуточной и дорсальной нейроэктодермой. Поскольку было обнаружено, что Msh является репрессором ind , репрессия msh через Vnd является предпосылкой для активации ind в промежуточном тритоцеребруме (переднем) и дейтоцеребруме. В стволе экспрессия ind в промежуточной нейроэктодерме начинается раньше, чем экспрессия msh в дорсальной нейроэктодерме, и домены msh и vnd не соприкасаются; соответственно, репрессивное взаимодействие между Msh и Vnd не требуется (Seibert, 2010)

В тритоцеребруме Vnd действует как репрессор не только msh , но также и , в отличие от дейтоцеребрума.Когда уровень белка Vnd в промежуточном тритоцеребруме снижается со временем (подавляется активностью Ems), впоследствии активируется и . В трито- и дейтоцеребруме, вместо Vnd, увеличивающиеся уровни Ind вместе с недавно обнаруженным msh -репрессором Nkx6 все еще сохраняют экспрессию msh , ограниченную дорсальной нейроэктодермой. Поскольку было обнаружено, что экспрессия Nkx6 начинается раньше и сохраняется дольше, чем экспрессия ind в обеих нейромерах мозга, и, кроме того, msh расширяется в промежуточную нейроэктодерму у Nkx6 , но не у мутантов ind , предполагается, что Nkx6 более эффективно репрессирует msh (Seibert, 2010)

Наиболее разительное различие в регуляции гена DV приводит к вопросу, как vnd и ind могут коэкспрессироваться в переднем дейтоцеребруме (на стадиях 6–9), если Vnd является репрессором ind и, наоборот, Ind также способен предотвращать экспрессию vnd в нейроэктодерме.Недавно сообщалось, что репрессорная активность Ind на vnd , по-видимому, является стадией, не происходящей до стадии 9. Напротив, репрессия Vnd ind кажется независимой от периода развития. В этом контексте интересно, что активность Vnd может быть модифицирована с помощью передачи сигналов EGFR, которая, как предполагается, влияет на избирательное взаимодействие Vnd с кофакторами, необходимыми для обеспечения репрессии или активации генов-мишеней. Доступность кофакторов также может объяснять специфическую ситуацию коэкспрессии vnd и ind в переднем дейтоцеребруме, которая наблюдалась на ранних стадиях развития (Seibert, 2010).

Участие и , который может действовать как репрессор транскрипции, а также как активатор, было вовлечено в различные процессы развития у Drosophila , такие как компартментализация в раннем эмбрионе, модуляция экспрессии гена Hox или регуляция молекул, которые непосредственно управляют ростом аксонов (например,грамм. измученный ). Это исследование демонстрирует новую функцию En у ранних эмбрионов, а именно контроль пространственно ограниченной экспрессии генов DV в нейромерах задней части мозга (трито- и дейтоцеребрум) и вентральном нервном канатике. В заднем отделе дейтоцеребрума En репрессирует экспрессию msh и ind , но поддерживает экспрессию vnd . Поскольку было обнаружено, что Ind (позже) становится репрессором vnd , это указывает на то, что En поддерживает экспрессию vnd путем репрессии ind .В заднем отделе тритоцеребрума En также необходим для подавления Msh, но в отличие от дейтоцеребрума En необходим для активации и . Это исследование показывает, что Msh является репрессором ind , его репрессия с помощью En, по-видимому, позволяет активировать ind ; тем не менее, нельзя исключить, что En дополнительно непосредственно активирует экспрессию и . Подобно ситуации в тритоцеребруме, En, по-видимому, отрицательно регулирует экспрессию msh и положительно регулирует экспрессию ind (как поддерживающий фактор) в нейроэктодерме вентрального нервного канатика.Вместе эти данные подтверждают, что ген формирования AP паттерна , закрепленный , критически участвует в тонкой настройке регионализированной экспрессии отдельных DV генов в заднем компартменте нейромеров в головном мозге и вентральном нервном канатике. En может действовать как положительный или отрицательный регулятор транскрипции в зависимости от регулируемого гена и сегментарного контекста. Для генов DV известно, что они контролируют образование и спецификацию нейробластов головного мозга. Поскольку все генетические взаимодействия между генами En и DV происходят в период развития нейробластов, вполне вероятно, что En посредством регуляции генов DV контролирует формирование и спецификацию судьбы нейробластов в головном мозге (Seibert, 2010).

Было обнаружено, что перекрестное репрессивное взаимодействие между парами факторов генов DV в головном мозге (т.е. in trito- и deutocerebrum) важен для установления и поддержания дискретных доменов экспрессии генов DV. Ранняя перекрестная репрессия между Ems / Vnd формирует паттерн вентральной и промежуточной нейроэктодермы в обеих нейромерах. Взаимная репрессия между Msh / Nkx6 и Msh / Ind поддерживает дорсальную / промежуточную нейроэктодермальную границу в трито- и дейтоцеребруме и между Ind / Vnd промежуточную / вентральную границу в тритоцеребруме. Все эти генетические взаимодействия и наблюдение, что Msh и Vnd действуют как взаимные репрессоры, не соответствуют концепции вентрального доминирования (как предполагается в нейроэктодерме вентрального нервного канатика, где более вентральный ген репрессирует ген, более выраженный дорсально). а скорее поддерживают модель, согласно которой в мозге перекрестная репрессия между факторами DV имеет решающее значение для стабилизации этих границ (Seibert, 2010)

Однако, несмотря на способность Msh и Ind репрессировать vnd , ни один фактор не кажется достаточным для определения дорсальной границы экспрессии vnd в трито- и дейтоцеребруме, как было показано для Ind в вентральном нервном канатике. (начиная с 9 этапа).Вместо усиления этой границы посредством репрессивного взаимодействия, экспрессия vnd в мозге также может быть ограничена (слишком) низкой концентрацией или отсутствием активатора, такого как дорсальный (как предполагалось для ствола), или регулироваться BMP. передача сигналов в зависимости от дозировки. Специфические для нейромеров различия также наблюдаются в отношении ограничения доменов экспрессии ind и msh вдоль оси DV. Vnd устанавливает вентральную границу экспрессии ind в туловище и tritocerebrum, но не в дейтоцеребруме или протоцеребруме (где домены экспрессии ind и vnd не соприкасаются).Было обнаружено, что экспрессия ind ограничена дорсально репрессией через Msh в трито- и дейтоцеребруме, но не в протоцеребруме (где msh не экспрессируется до стадии 11) или стволе, хотя имеются доказательства того, что Msh может действовать в визуализируя дорсальную границу экспрессии и более точно в вентральном нервном канатике. Принимая во внимание, что экспрессия ind не распространяется на полную дорсальную нейроэктодерму трито- и дейтоцеребрума у ​​мутантов msh , это также может указывать на участие ядерного дорсального градиента, возможно, в сочетании с градуированной активностью EGFR (как было показано для нейроэктодермы туловища) или BMP (который может репрессировать ind в нейроэктодерме туловища) в установлении грубой дорсальной границы экспрессии ind , которая в дальнейшем определяется и стабилизируется посредством репрессии с помощью Msh.В то время как Vnd изначально ответственен за поддержание экспрессии msh , ограниченной дорсальной нейроэктодермой в trito- и deutocerebrum, он только косвенно участвует в определении вентральной границы экспрессии msh в нейроэктодерме туловища. Позже в развитии Ind помогает поддерживать репрессию msh в трито- и дейтоцеребруме (вместе с Nkx6), что отличается от ствола, где Ind непосредственно устанавливает вентральный предел экспрессии msh с самого начала (Seibert, 2010).

DV нейроэктодермальные и соответствующие домены стволовых клеток в головном мозге Drosophila устанавливаются и поддерживаются посредством кросс-репрессивной регуляции, и предполагалось, что такие генетические взаимодействия более распространены в мозге мух.В этом исследовании представлены дополнительные примеры, подтверждающие эту гипотезу. Примечательно, что это свойство, которое имеет сходство с формированием DV-паттерна в нервной трубке позвоночных, где кросс-репрессивные взаимодействия гомеодоменных белков являются обычными и действительно важными для установления дискретных доменов-предшественников DV (Seibert, 2010)

Все взаимодействия между генами DV в головном мозге, идентифицированные до сих пор, основаны на взаимодействии репрессоров транскрипции. Аналогичным образом, это исследование показывает, что Vnd не действует как прямой активатор для положительной регуляции ind , но, согласно двойному отрицательному механизму, он подавляет ind -репрессор Msh.Ранее было показано, что взаимодействия гена формирования паттерна AP ems с генами DV ( vnd , ind , msh и Nkx6 ) необходимы для правильного развития трито- и дейтоцеребрума. Это исследование демонстрирует, что ген сегментации и в значительной степени участвует в регионализации доменов экспрессии гена DV, представляя тем самым еще один пример гена формирования паттерна AP, интегрирующегося в регуляторную сеть гена DV, которая формирует паттерн мозга.Это исследование показало, что En по-разному действует на соответствующие гены DV, но нет доказательств того, что, наоборот, гены DV контролируют en , как это наблюдалось для экспрессии ems . Все гены DV, а также En и Ems содержат репрессорный домен Eh2 и способны взаимодействовать с корепрессором Groucho (Gro) и, таким образом, способны опосредовать репрессию целевых генов (включая друг друга). Но как могло быть возможно, чтобы все гены DV взаимодействовали с одним и тем же кофактором, чтобы стабилизировать домены экспрессии, обеспечивая репрессию генам, экспрессируемым в соседних доменах? Во-первых, гены DV обнаруживают пространственно-временные различия в их соответствующей экспрессии.Кроме того, конформационные изменения белка, по-видимому, необходимы для связывания Gro, что, по крайней мере, было показано для Nkx6. Было замечено, что Vnd может фосфорилироваться активированным MAPK и присутствует в различных изоформах в развивающемся эмбрионе, что, скорее всего, приводит к изменению его партнеров по связыванию. Другим критическим моментом может быть инактивация корепрессора, в случае Gro также посредством фосфорилирования с помощью активированного MAPK, или модификация генов-мишеней, так что связывание репрессорного комплекса нарушается.Тем не менее, то, что гены DV способны взаимодействовать с Groucho, не исключает того, что их репрессорная активность не зависит от Gro, поскольку для этих генов были зарегистрированы также другие репрессорные домены, а также домены активаторов, по крайней мере, для Vnd, Ind, и Nkx6. Функционируют ли продукты гена DV в качестве репрессоров или активаторов, по-видимому, зависит от доступности кофакторов, а также от соответствующего гена-мишени, поскольку в этом контексте ограничивается не только наличие сайта связывания транскрипции, но и его доступность (Seibert, 2010)

Модель консервативного механизма, формирующего нейроэктодерму

Рисунок 4.

Дозозависимая BMP-опосредованная репрессия в эксплантатах нервной пластинки

(A) Эксплантаты промежуточной нервной пластинки цыплят выращивали в 5 нМ Shh и диапазоне BMP4 от 0 до 2,4 нМ. Клетки окрашивали антителами к Nkx2.2, Pax6 или Msx1 / 2, подсчитывали количество положительных клеток на эксплант, рассчитывали процент положительных клеток и отображали в виде графика. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку среднего. Количество исследованных эксплантов было следующим, начиная с 0 нМ и заканчивая 2.4 нМ BMP4: Nkx2.2 (25, 12, 15, 18, 12), Pax6 (18, 6, 18, 24, 30, 12, 24, 28) и Msx1 / 2 (12, 6, 16, 11 , 17, 11, 17, 17).

(B) Промежуточные эксплантаты нервной пластинки (NP) цыплят с (слева) или без (справа) BMP-экспрессирующей ненейральной эктодермальной тканью (EC), помещенной на верхний край и культивированной в присутствии 5 нМ Shh. Доля клеток, экспрессирующих Msx1 / 2, наиболее высока вблизи источника BMP (вверху слева) и уменьшается в зависимости от расстояния от эктодермы. В отдельной совместной культуре нервной пластинки / эктодермы (внизу, слева) Pax6 экспрессируется на большем расстоянии от эктодермы, но не в соседних клетках нервной пластинки, которые предположительно экспрессируют Msx1 / 2.Эти результаты имитируют домены относительной экспрессии Msx1 / 2 и Pax6 в нервной трубке цыпленка на стадии 20 (крайний справа).

(C) Упрощенная сводная модель, показывающая предполагаемое сходство в BMP-опосредованном формировании паттерна нейроэктодермы позвоночных и беспозвоночных. Два процесса взаимодействуют для установления паттерна экспрессии гена нейральной идентичности у Drosophila и позвоночных: ступенчатая передача сигналов BMP предпочтительно подавляет экспрессию вентральных генов нейральной идентичности (слева), которые затем участвуют в цепи вентрально-доминантной репрессии, при которой преобладает большее количество вентральных генов. в подавлении экспрессии большего количества дорсальных генов (справа).Указанное ингибирование Msx1 / 2 с помощью Pax6 остается гипотетическим. На этой схеме не указаны дополнительные уровни перекрестного ингибирования (например, ингибирование Vnd msh, поздняя репрессия Ind vnd, и репрессия Pax6 Nkx2.2 ) [9,10,16,21,61 , 62], которые, вероятно, помогают обострять и уточнять паттерн, создаваемый основным механизмом пороговой зависимой репрессии BMP, связанной с вентральным доминированием.

Подробнее »

ген гомеобокса vnd определяет идентичность вентральной колонки

1. Джоселин А.Макдональдс1,2,
2. Скотт Холбрук2,
3. Такако Иссики1,2,
4. Джозеф Вайс3,
5. Крис К. Доу1,2,5 и
6. Дервла М. Меллерик4,5

1. ¹ Институт неврологии, Орегонский университет, Юджин, Орегон 97403 США; ² Департамент клеточной и структурной биологии, Университет Иллинойса / Медицинский институт Говарда Хьюза (HHMI), Урбана, Иллинойс 61801; ³ Департамент биологии развития, HHMI, Медицинская школа Стэнфордского университета, Стэнфорд, Калифорния 94305 США; ⁴ Исследовательские лаборатории детской неврологии, Медицинский центр Мичиганского университета, Анн-Арбор, Мичиган 48109 США

Аннотация

ЦНС Drosophila развивается из трех столбцов нейроэктодермальных клеток вдоль дорсовентральной (DV) оси: вентральной, промежуточной и дорсальной.В этой и сопроводительной статье мы исследуем роль двух генов гомеобокса, vnd и ind , в установлении судьбы вентральных и промежуточных клеток в ЦНС Drosophila . Во время раннего нейрогенеза белок Vnd ограничен нейроэктодермой вентрального столба и нейробластами; позже это обнаружено в сложной структуре нейронов. Мы используем молекулярные маркеры, которые различают нейроэктодерму вентральной, промежуточной и дорсальной колонн. и нейробласты, а также маркер клеточной линии для выбранных нейробластов, чтобы показать, что потеря vnd трансформирует вентральную идентичность в промежуточную колонку и что специфические вентральные нейробласты не могут образоваться.И наоборот, внематочный vnd производит промежуточную трансформацию в вентральную колонку. Таким образом, vnd необходимо и достаточно, чтобы индуцировать вентральные судьбы и репрессировать промежуточные судьбы в ЦНС Drosophila . Гомологи позвоночных vnd ( Nkx2.1 и 2.2 ) аналогичным образом экспрессируются в вентральной ЦНС, что повышает вероятность того, что формирование DV паттерна в ЦНС является эволюционным. законсервировано.

Сноски

• №5 Для корреспонденции.

• ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА cdoe {at} uoneuro.uoregon.edu; ФАКС (541) 346-4736; ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА dervla_mellerick.педиатрия mailgw.surg.med.umich.edu; ФАКС (734) 7644279.

• • Поступила 10.08.1998 г.
  • Принята к печати 23 сентября 1998 г.
• Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

Мутации, которые влияют на способность гомеопротеина vnd / NK-2 регулировать экспрессию гена: трансгенные изменения и третичная структура

Реферат

Значение третичной структуры и специфичности связывания ДНК белка, кодируемого анализируется ген гомеобокса vndNK-2.Паттерны эктопической экспрессии WT и четырех мутантных генов vndNK-2 анализируются вместе с экспрессией двух нижележащих генов-мишеней, ind и msh, которые подавляются с помощью vndNK-2. Три мутанта представляют собой делеции консервативных областей (то есть мотива оловянного, кислотного мотива и NK-2-бокса), а четвертый, Y54M vndNK-2, соответствует замене одного аминокислотного остатка в гомеодомене. Из четырех исследованных эктопически экспрессируемых мутантных генов только мутация Y54M инактивирует способность гомеодоменного белка vndNK-2 репрессировать ind и msh.Мутант с делецией кислого мотива несколько снижал способность белка репрессировать ind и msh. Напротив, мутанты с делецией по боксу tinman и NK-2 вели себя как функциональные гены vndNK-2 в своей способности репрессировать ind и msh. Определенные ЯМР третичные структуры гомеодомена vndNK-2 Y54M, как свободные, так и связанные с ДНК, сравнивают с аналогом WT. Единственное структурное различие, наблюдаемое для мутантного гомеодомена, заключается в комплексе с ДНК и связано с более тесным взаимодействием метионина-54 с A2, а не t…Продолжить чтение

Ссылки

28 июля 1989 г. · Biochimica Et Biophysica Acta · MP ScottG W Hartzell

1 октября 1989 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Y Kim, M Nirenberg

5 июня 1987 г. · Наука · WJ Gehring

1 марта 1994 г. · Биология развития · Э. Бобер Х. Арнольд

1 октября 1995 г. · Биология развития · DM Mellerick, M. Nirenberg

30 июня 1995 г. · Annals of Нью-Йоркская академия наук · M NirenbergR Lad

11 августа 1995 г. · Журнал молекулярной биологии · DH TsaoJ A Ferretti

30 июня 1995 г. · Журнал биологической химии · CY Chen, RJ Schwartz

11 августа 1994 г. · Исследования нуклеиновых кислот · G DamanteR Di Lauro

1 января 1994 г. · Ежегодный обзор биохимии · WJ GehringT Bürglin

20 декабря 1994 г. · Биохимия · DH TsaoJ A Ferretti

15 февраля 1993 г. · Труды Национальной академии наук Науки Соединенных Штатов Америки · AF Schier, WJ Gehring

1 января 1996 г. · Гены и развитие · S KimuraF J Gonzalez

15 сентября 1996 г. · Биология развития · RP Harvey

1 августа 1996 г. · Механизмы развития · M D’Alessio, M Frasch

6 мая 1997 г. · Биохимия · JM GruschusJ A Ferretti

6 июня 1998 г. · Журнал биологической химии · S WeilerJ A Ferretti

23 мая 1998 г. · Исследование кровообращения · H KasaharaS Izumo

8 июля 1998 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · HH SaundersM Nirenberg

1 декабря 1998 г. · Гены и развитие · JB WeissM P Scott

1 декабря 1998 г. · Гены и развитие · JA McDonaldD M Mellerick

1 декабря 1998 г. · Гены и развитие · H ChuF Jiménez

5 июня 1999 г. · Журнал молекулярной биологии · JM GruschusJ A Ferretti

24 ноября 1999 г. · Журнал биологической химии · CY ChoiY Kim

21 июля 2000 г. · Журнал клинических исследований · H KasaharaS Izumo

6 августа 2000 г. · Биология развития · Т. фон Олен, CQ Doe

16 августа 2000 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · H WatadaM S German

17 января 2002 г. · Journal of Neurobiology · Дервла М. Меллерик, Виктория Модика

21 февраля 2002 г. · Журнал клинических исследований · Хайко Круде Аннетт Грютерс

17 сентября 2002 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Лан-Сян Ван Маршалл Ниренберг

1 августа 1997 г. · Прикладная оптика · Дж. Ли Р. У. Коллинз

Цитаты

3 августа 2005 г. · Клеточная и молекулярная нейробиология · З. Н. Акин, А. Дж. Назарали

29 сентября 2009 г. · Биохимия · Чон Хо Джу Джеймс М. Грушус

24 декабря 2008 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Джунг-Ву Хонг Майкл С. Левин

11 января 2005 г. · Исследование нуклеиновых кислот · Чжунсинь ЮДервла М. Меллерик

23 марта 2011 г. · Nu Исследования клеиновых кислот · Александр Г. СтепченкоСофия Георгиева

30 ноября 2005 г. · Молекулярная и клеточная биология · Роберт Э. Гольдштейн Зеев Паруш

18 января 2006 г. · BMC Bioinformatics · Маркус Брамайер Роберт М. · Сиук Ю

5 мая 2005 г. · Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки · Лан-Сян Ван Маршалл Ниренберг

19 августа 2007 г. · Американский журнал генетики человека · Иньин ЦиньАлександар Раджкович

4 июля, 2006 · Журнал молекулярной биологии · Чон Хо Джу Джеймс М. Грушус

31 октября 2006 г. · Механизмы развития · Джей УлерДервла М. Меллерик

18 января 2020 г. · Молекулярная нейробиология · Судершана Наирджэ Х Парк

7 октября 2004 г. · Белки · Александрас Гутманас, Мартин Биллетер

RCSB PDB — 1NK3: VND / NK-2 ГОМЕОДОМАН / ДНК-КОМПЛЕКС, ЯМР, МИНИМИЗИРОВАННАЯ СРЕДНЯЯ СТРУКТУРА

Взаимодействия, ответственные за специфичные для нуклеотидной последовательности b Было идентифицировано присоединение гомеодомена vnd / NK-2 Drosophila melanogaster к его консенсусному сайту связывания ДНК.Представлена ​​трехмерная структура комплекса гомеодомен vnd / NK-2-ДНК с акцентом на структуру областей наблюдаемых контактов белок-ДНК …

Взаимодействия, ответственные за специфическое для нуклеотидной последовательности связывание vnd Гомеодомен / NK-2 Drosophila melanogaster к его консенсусному участку связывания ДНК не идентифицирован. Представлена ​​трехмерная структура комплекса гомеодомен vnd / NK-2-ДНК с акцентом на структуру областей наблюдаемых контактов белок-ДНК.Эта структура основана на ограничениях расстояния белок-ДНК, полученных из данных ЯМР, наряду с моделированием гомологии, сольватированной молекулярной динамикой и результатами экспериментов по интерференции метилирования и этилирования. Спираль III гомеодомена связывается в большой бороздке ДНК, а N-концевое плечо связывается в малой бороздке по аналогии с другими комплексами гомеодомен-ДНК, структуры которых описаны. Гомеодомен vnd / NK-2 распознает необычную консенсусную последовательность ДНК 5′-CAAGTG-3 ‘. Описаны роли в специфичности последовательности и силе связывания отдельных аминокислотных остатков, которые контактируют с ДНК.Мы показываем, основываясь в первую очередь на наблюдаемых контактах белок-ДНК, что взаимодействие Y54 с ДНК является основной детерминантой этой необычной специфичности связывания нуклеотидов в комплексе vnd / NK-2 гомеодомен-ДНК.

---

Ссылки по теме: & nbsp

• Взаимодействия гомеодомена Vnd / Nk-2 с ДНК с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса: основа специфичности связывания
  Gruschus, J.M., & NbspTsao, D.Hberg., & NbspWang, L.H., & nbspFerretti, J.A.
  (1997) Biochemistry & nbsp 36: 5372

• Трехмерная структура решения гомеодомена Nk-2 от Drosophila
  Tsao, DH, & nbspGruschus, JM, & nbspbergWang, LH, & nbsp. JA
  (1995) J Mol Biol 251: 297

• Удлинение спирали III гомеодомена Nk-2 при связывании с ДНК: исследование вторичной структуры с помощью ЯМР
  Tsao, D.H., & NbspGruschus, J.M., & NbspWang, L.H., & NbspNirenberg, M., & nbspFerretti, J.A.
  (1994) Biochemistry & nbsp 33: 15053

---

Организационная принадлежность : & nbsp

Лаборатория биофизической химии, Национальный институт сердца, легких и крови, Бетесда, Мэриленд, 20892-0380, США.

Скрыть аннотацию

Учебные материалы | Биология бакалавриат

Учебные материалы для инструкторов по программе биологии

Управление бакалавриата биологии стремится обеспечить всем преподавателям инструменты для оценки своих курсов BIOL, создавая при этом более прозрачный, понятный и инклюзивный опыт обучения для всех студентов.Инструкторам доступны следующие ресурсы:

Учебные планы курса — это один из первых документов, которыми совместно пользуются преподаватель и студент, которые устанавливают ожидания в отношении опыта курса. Есть ли в вашей программе необходимое и рекомендованное содержание Программы по биологии и Центра Шеридан?
Загрузите интерактивный контрольный список и узнайте.

«Практические инструкции» для написания целей обучения в измеримом формате

Исследования показывают, что курсы, в которых используются конкретные и измеримые цели обучения, создают прозрачность и способствуют инклюзивному обучению для всех учащихся.Программа по биологии нацелена на обеспечение того, чтобы все курсы BIOL предоставляли студентам конкретные, измеримые, достижимые, актуальные и своевременные цели обучения — так называемый формат «SMART».
Ваши цели SMART? Загрузите эту инфографику на номер и узнайте!

Руководство по интеграции заявлений о разнообразии и инклюзивности в учебные программы курса

Заявления о разнообразии и инклюзивности предоставляют учащимся информацию о важности уважения множества точек зрения в классе.Это может включать в себя важность уважения и оценки происхождения, идентичности и опыта других.
Есть ли в вашем учебном плане заявление о разнообразии и инклюзивности? Загрузите это справочное руководство , чтобы узнать больше о том, как включить эту информацию, и примеры.

Программа по биологии для младших преподавателей (UTA)

Преподавание — это ценная возможность обучения и трудоустройства для наших студентов бакалавриата и новый опыт для многих из них.Рекомендации по найму UTA и четкие ожидания относительно того, когда они работают, приводят к успешным партнерским отношениям.
Хотите узнать больше о правилах UTA или вам нужна помощь в написании ваших ожиданий от UTA? Загрузите этот шаблон и руководство по ресурсам , чтобы узнать больше.

Интеграция инклюзивных педагогических практик в ваш курс Практика инклюзивного преподавания гарантирует, что все студенты могут взаимодействовать с содержанием курса, эффективно учиться и демонстрировать свои знания с помощью различных методов оценки.Эти практики поддерживают обучение у всех учащихся, но в особенности у тех, кто входит в исторически недопредставленные группы (HUG).
Включаете ли вы инклюзивные методы преподавания в свои курсы? Если это так, добавьте его в общий документ «Инклюзивные практики в курсах биол и неврологии» . Или загрузите это справочное руководство , чтобы узнать больше о внедрении инклюзивной педагогической практики.

Мы приглашаем вас сотрудничать с нами, назначив консультацию 1-1 по объединению этих ресурсов с Тони-Мари Ахилли или Кристиной Монтейро, назначив время, используя ссылки на наши календари ниже.Консультации могут включать предоставление дополнительной информации, обратную связь или даже письменное сообщение.

Тони-Мари Ачилли, PhD
Заместитель декана по биологии бакалавриата
[адрес электронной почты защищен] или
Calendly

Кристина Монтейро, PhD
Директор по академической оценке и оценке в биологии
[адрес электронной почты защищен] или
Calendly

Связанные файлы .