ГОСТ 33401-2015 Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Определение констант диссоциации в воде титриметрическим, спектрометрическим и кондуктометрическим методами, ГОСТ от 12 октября 2015 года №33401-2015
ГОСТ 33401-2015
________________
* Текст документа соответствует оригиналу. — Примечание изготовителя базы данных
МКС 13.020.01
Дата введения 2016-09-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 339 «Безопасность сырья, материалов и веществ» на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного документа, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 22 июля 2015 г. N 78-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Казахстан | KZ | Госстандарт Республики Казахстан |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 октября 2015 г. N 1529-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33401-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2016 г
5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD, Test No. 112:1981* «Константы диссоциации в воде (титриметрический метод — спектрофотометрический метод — кондуктометрический метод)» [«Dissociation constants in water (Titration method — Spectrophotometric method — Conductometric method)», MOD] путем изменения структуры. Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа приведено в дополнительном приложении ДА.
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. — Примечание изготовителя базы данных.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Май 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
1 Область применения
1.1 Настоящий стандарт устанавливает титриметрический, спектрофотометрический, кондуктометрический методы определения константы диссоциации в воде. Методы могут быть применены для чистых или технически чистых веществ. При проведении испытания следует учитывать возможное влияние примесей на результаты.
1.2 Титриметрический метод не может использоваться для плохо растворимых соединений.
1.3 Спектрофотометрический метод может использоваться только для соединений, обладающих существенно различающимися спектрами поглощения диссоциированных и недиссоциированных форм в УФ/видимой области спектра. Данный метод также применим для соединений с низкой растворимостью и соединений, диссоциация которых проходит не по кислотно-основному типу, например комплексных соединений.
1.4 В случаях, когда применимо уравнение Онзагера, может быть использован кондуктометрический метод. Метод может использоваться даже при умеренно низких концентрациях и в случаях, когда диссоциация исследуемого соединения проходит не по кислотно-основному типу.
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:
2.1 диссоциация (dissociation): Обратимый распад химического соединения в воде на две или более составляющих, которые могут представлять собой ионы.
3 Общие сведения
3.1 Процесс диссоциации химического вещества в воде имеет значение для оценки его потенциального воздействия на окружающую среду. Способность к диссоциации определяет форму вещества, которая, в свою очередь, определяет его трансформации и перенос в окружающей среде. Способность к диссоциации оказывает влияние на адсорбцию химического вещества в почвах и донных отложениях и возможность проникновения в биологические клетки.
3.2 Исследуемые показатели и единицы измерения
Диссоциация описывается уравнением
. (1)
Константа равновесия реакции (константа диссоциации) определяется по соотношению:
. (2)
Например, в частном случае, когда представляет собой атом водорода (диссоциирующее вещество является кислотой), константа диссоциации определяется как
(3)
или
. (4)
4 Стандартные вещества
4.1 Использование стандартных веществ необходимо для периодической калибровки и верификации оборудования и возможности сопоставления результатов в случае применения разных методов. Использование стандартных веществ во всех случаях при испытании нового вещества не требуется.
4.2 Рекомендуется использовать стандартные вещества, указанные в таблице 1.
Таблица 1 — Перечень стандартных веществ
Наименование вещества | [1] | Температура, °С |
п-нитрофенол | 7,15 | 25 |
Бензойная кислота | 4,12 | 20 |
п-хлоранилин | 3,93 | 20 |
Примечание — Для п-нитрофенола отсутствуют значения константы диссоциации при температуре 20°С. Можно допустить, что вариативность результатов измерений выше, чем ожидаемая зависимость от температуры.
4.3 В качестве стандартного вещества также рекомендуется использовать вещество с несколькими значениями константы диссоциации, например лимонную кислоту (см. таблицу 2).
Таблица 2 — Константы диссоциации лимонной кислоты
Наименование вещества | [1] | Температура, °С |
Лимонная кислота | 3,14 | 20 |
4,77 | 20 | |
6,39 | 20 |
5 Принцип испытания
5.1 Информация об исследуемом веществе
Для исследуемого вещества должны быть известны его структурная формула, растворимость в воде, предпочтительный метод аналитического определения, а также, в случае использования кондуктометрического метода, электропроводность.
5.2 Процесс диссоциации химического соединения в воде, как правило, незначительно зависит от температуры в диапазоне, характерном для окружающей среды. Для определения константы диссоциации необходимо измерение концентраций диссоциированных и недиссоциированных форм химического соединения. Затем на основании стехиометрического уравнения реакции диссоциации можно рассчитать соответствующую константу диссоциации. В случае, представленном в настоящем стандарте, предполагается диссоциация химического соединения по кислотно-основному типу, поэтому измерение удобно проводить путем регистрации соответствующих концентраций диссоциированных и недиссоциированных форм химического соединения и рН тестируемого раствора. Измеряемые показатели связаны между собой соотношением (4) (см. 3.2). Некоторые химические соединения имеют несколько констант диссоциации, для вычисления которых могут быть получены аналогичные соотношения. Некоторые методы, представленные в настоящем стандарте, также подходят для исследования диссоциации, происходящей не по кислотно-основному типу.
6 Достоверность испытания
6.1 Воспроизводимость
Значение константы диссоциации, полученное в трех тестах, должно воспроизводиться в пределах ±0,1 логарифмических единиц.
7 Основные положения
7.1 Существует два основных подхода к определению константы диссоциации. Первый подход заключается в титровании известного количества химического соединения стандартной кислотой или основанием в установленном порядке; второй подход включает определение соответствующих концентраций диссоциированных и недиссоциированных форм химического соединения и их зависимости от уровня рН.
7.2 Подготовка к испытанию
Методы, основанные на указанных подходах, классифицируются как титриметрический, спектрофотометрический и кондуктометрический.
7.3 Приготовление тестируемых растворов
7.3.1 При использовании титриметрического и кондуктометрического методов для приготовления тестируемого раствора химическое вещество растворяют в дистиллированной воде. При использовании спектрофотометрического и других методов для приготовления тестируемого раствора используют буферные растворы. Концентрация исследуемого вещества не должна превышать 0,01 М или составлять половину концентрации насыщения раствора. Для приготовления тестируемых растворов необходимо использовать наиболее чистую из доступных форм исследуемого вещества. Если вещество незначительно растворимо в воде, то его предварительно следует растворить в небольшом количестве водорастворимого растворителя.
7.3.2 Приготовленные тестируемые растворы следует проверить на присутствие эмульсий с использованием конуса Тиндаля, особенно если для повышения растворимости был использован дополнительный растворитель. В случае применения буферных растворов их концентрация не должна превышать 0,05 М.
7.4 Условия проведения испытания
7.4.1 Температура
7.4.1.1 Необходимо контролировать температуру в диапазоне ±1°С. Испытание проводят при температуре 20°С.
7.4.1.2 Если предполагается, что константа диссоциации значительно зависит от температуры, то испытание проводят как минимум при двух значениях температуры. В таком случае интервал температур должен составлять 10°С, контроль температуры осуществляют с точностью ±0,1°С.
7.4.2 Методы аналитического определения
Выбор аналитического метода определяется свойствами исследуемого вещества. Метод должен быть достаточно чувствительным для возможности определения различных форм исследуемого вещества в тестируемом растворе.
8 Процедура испытания
8.1 Титриметрический метод
Тестируемый раствор титруют стандартным раствором щелочи или кислоты соответственно, измеряя значение рН после каждого добавления титранта. До достижения точки равновесия проводят не менее 10 последовательных добавлений. Если равновесие достигается достаточно быстро, то используют регистрирующий потенциометр. При использовании данного метода необходимо точно знать общее количество исследуемого вещества и его концентрацию в тестируемом растворе. Следует принять меры для исключения диоксида углерода из тестовой системы. Подробное описание метода, рекомендации по его использованию, а также необходимые расчеты приведены в [1]-[4].
8.2 Спектрофотометрический метод
Определяют длину волны, при которой диссоциированные и недиссоциированные формы исследуемого вещества имеют существенно различающиеся коэффициенты экстинкции (поглощения). Спектр поглощения в УФ/видимой области получают с использованием растворов с постоянной концентрацией и уровнем рН, при котором вещество в основном или полностью диссоциировано, и при нескольких промежуточных значениях уровня рН. Получение промежуточных значений уровня рН достигается последовательным добавлением концентрированной кислоты (щелочи) к относительно большому объему раствора исследуемого вещества в многокомпонентном буфере, первоначально при высоком (низком) уровне рН [5], или добавлением равных объемов основного раствора исследуемого вещества, например в воде, метаноле, к постоянным объемам различных буферных растворов, включающих требуемый диапазон значений уровня рН. По значениям рН и коэффициента поглощения при выбранной длине волны рассчитывают достаточное число значений константы диссоциации с использованием данных как минимум при пяти значениях уровня рН, когда исследуемое вещество диссоциировано не менее чем на 10% и не более чем на 90%. Подробное описание процедуры испытания и метод расчета приведены в [1].
8.3 Кондуктометрический метод
Измеряют электропроводность 0,1 М раствора исследуемого вещества в воде, используя кондуктометрическую ячейку с известной константой малой величины. Также измеряют электропроводности ряда точно приготовленных разведений данного раствора (концентрацию каждый раз уменьшают в два раза, и концентрации тестируемых растворов в серии должны отличаться как минимум на порядок). Значение предельной электропроводности при бесконечно малом разбавлении устанавливают при проведении аналогичного испытания с солью натрия методом экстраполяции. Степень диссоциации исследуемого вещества может быть определена из значения электропроводности каждого раствора с использованием уравнения Онзагера. Следовательно, применяя закон разведения Оствальда, константу диссоциации рассчитывают по соотношению
, (5)
где — концентрация тестируемого раствора, моль/л;
— степень диссоциации.
Следует принять меры для исключения диоксида углерода из тестовой системы. Подробное описание процедуры испытания и метод расчета приведены в [1], [6] и [7].
9 Данные и отчет о проведении испытания
9.1 Обработка результатов
9.1.1 Титриметрический метод
Вычисляют значение константы диссоциации для 10 измеренных точек на кривой титрования. Вычисляют среднее значение и стандартное отклонение для значений . Данные представляют в табличной форме и строят график зависимости уровня рН от объема титранта.
9.1.2 Спектрофотометрический метод
В табличной форме представляют данные о поглощении и уровня рН для каждого спектра. Рассчитывают как минимум пять значений константы диссоциации по промежуточным точкам спектров. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение для таких значений.
9.1.3 Кондуктометрический метод
Рассчитывают эквивалентную электропроводность для каждой концентрации кислоты и для каждой концентрации смеси одного эквивалента кислоты с 0,98 эквивалента гидроксида натрия, не содержащего карбонат. Избыток кислоты используют для предотвращения повышения содержания гидроксид-ионов вследствие гидролиза. Строят график зависимости 1/ от , и соли находят экстраполяцией к нулевой концентрации. кислоты можно рассчитать с использованием справочных значений для H и Na. Значение рассчитывают для каждой концентрации по соотношениям:
(6)
и
. (7)
Наиболее приемлемые значения константы диссоциации рассчитывают с поправкой на подвижность и активность. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение значений .
9.2 Отчет о проведении испытания
9.2.1 Все полученные данные и рассчитанные значения константы диссоциации представляют в табличной форме с указанием метода расчета и статистических параметров. Для титриметрического метода приводят описание стандартизации титрантов.
9.2.2 Для спектрофотометрического метода указывают все спектры.
9.2.3 Для кондуктометрического метода приводят расчет константы кондуктометрической ячейки.
9.2.4 Также в отчете о проведении испытания указывают используемое оборудование, используемые аналитические методы, состав используемых буферных растворов и температуру(ы) проведения испытания.
Приложение ДА (справочное). Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа
Приложение ДА
(справочное)
Структура международного документа | Структура межгосударственного стандарта |
Раздел 1 | Раздел 1 |
Раздел 2 | — |
Подраздел A | Раздел 2 |
Раздел 3 | |
Раздел 4 | |
Раздел 5 | |
Раздел 6 | |
Подраздел В | Раздел 7 |
Раздел 8 | |
Раздел 3 | Раздел 9 |
Раздел 4 | Библиография |
Библиография
[1] | Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of A cids and B ases, Wiley, Inc., New York, 1962 (Константы ионизации) |
[2] | Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969) |
[3] | ASTM D 1293 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974 |
[4] | Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976 (Стандартные методы исследования воды и сточных вод) |
[5] | Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973) (Быстрое спектрофотометрическое измерение констант ионизации в водном растворе) |
[6] | ASTM D 1125 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974 |
[7] | Standard Method 205 — APHA/AWWA/NPCF (see above) |
[8] | Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431(1980) (Руководство по химии и физике) |
УДК 658.382.3:006.354 | МКС 13.020.01 |
Ключевые слова: химическая продукция, окружающая среда, константа диссоциации | |
Электронный текст документа
подготовлен АО «Кодекс» и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2019
Методы определения степени электролитической диссоциации
Применяются также криоскопический и эбуллиоскопический методы определения степени электролитической диссоциации, о чем будет сказано в следующей главе.Опыт 1. Определение кажущейся степени электролитической диссоциации сильного электролита криоскопическим методом. Работа проводится в приборе, описанном в работе 16 (см. рис. 46). [c.117]
РАБОТА 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОТОНИЧЕСКОГО КОЭФФИЦИЕНТА РАСТВОРОВ ЭЛЕКТРОЛИТОВ И ИХ СТЕПЕНИ ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКОЙ ДИССОЦИАЦИИ ПО МЕТОДУ КРИОСКОПИИ [c.72]
СТЕПЕНЬ ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКОЙ ДИССОЦИАЦИИ И МЕТОДЫ ЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ [c.43]
Любое свойство, специфичное для ионов и зависящее от их концентрации, может быть использовано для определения степени диссоциации электролита в растворе, однако все известные методы-не противоречат теории электролитической диссоциации Аррениуса только в случае слабых электролитов. [c.378]
Мы уже познакомились с криоскопическим методом определения степени электролитической диссоциации. Измерение электропроводности является также одним из методов определения этой важной величины. [c.39]
Криоскопический и эбуллиоскопический методы применя ются также для определения степени электролитической диссоциации, что будет рассмотрено в следующей главе.
Криоскопический метод определения массы моля в растворах электролитов приводит не к истинной массе моля, а к меньи1ей по величине кажущейся массе моля Mj. Так, если в растворе находится п молекул электролита и степень электролитической диссоциации его равна а, то число молекул, распавшихся на ионы, будет па, а число нераспав-шихся молекул будет [c.17]
Методы определения степени электролитической диссоциации (а) в применении к сильным электролитам дают неправильные числа — закон действующих масс совершенно неприменим к сильным электролитам. В табл. 52 приведены значения а, найденные по понижению температуры вымерзания (ао м) и по электропроводности (а ) и вычисленные на основании этих величин постоянные электролитической диссоциации Косм и К>,-
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКОЙ ДИССОЦИАЦИИ [c.122]
Методы измерения электрической проводимости растворов широко применяют для определения констант электролитической диссоциации слабых электролитов, концентраций растворенных веществ или их растворимости, степени и константы гидролиза солей, содержания растворенной формы методом кондуктометрического титрования и т. д. [c.83]
Это дает возможность, измеряя температуру кипения раствора, концентрация которого известна, определить молекулярный вес растворенного вещества. Такой метод определения молекулярного веса называется эбулиоскопическим. В применении к растворам кислот, щелочей и солей он дает возможность определять степень электролитической диссоциации их.
Аррениус на основании многочисленных экспериментальных наблюдений показал, что для степени диссоциации а числовые значения получаются почти точно совпадающими как при вычислении их из уравнений (18), (19) и (19а), такш при определении йх на основании изменения молярной электропроводности с разведением [согласно уравнению (17)]. На основании этого он заключил, что значения а, определяемые этими двумя различными методами, действительно представляют собой степень диссоциации электролитов. Такая .классическая теория электролитической диссоциации оказывается правильной только для слабых электролитов. Как позже было показано, она не оправдывается для сильных электролитов.
КРИОСКОПИЯ (греч. kryos — холод и s opeo — смотрю) — определение молекулярной массы вещества измерением понижения температуры замерзания раствора по сравнению с температурой замерзания чистого растворителя. Л етод К. предложил Ф. Рауль в 1882— 1888 гг. для определения молекулярной массы растворенного вещества, а также его актнвносри в растворе, что дает возможность рассчитывать осмотическое давление, относительное понижение давления пара растворителя или степень электролитической диссоциации растворенного слабого электролита. На основании закона Ф. Рауля понижение 1ем-пературы замерзания раствора пропорционально его молекулярной концентрации. Метод К. применяется для определения содержания примесей при приготовлении веществ высокой степени чистоты,
Цель работы. 1. Практическое ознакомление с классическим методом определения электропроводимости раствора электролита и степени электролитической диссоциации растворенного вещества. 2. Определение удельной электропроводимости растворов уксусной кислоты различной концентрации (от Ve н. до Vo4 ) 3. На основании полученных экспериментальных данных вычислить а) эквивалентную электропроводимость указанных выше растворов б) степень электролитической диссоциации тех же растворов в) константу электролитической диссоциации уксусной кислоты. Принадлежности для работы. Аккумулятор выключатель индукционная катушка с регулируемым прерывателем реохорд магазин сопротивлений (1—1000 ом)- сосуд для измерения электропроводимости растворов телефон (лучше с ламповым усилителем) электрические провода и соединительные клеммы два стакана на 300 мл две бюретки на 50 мл с делениями в 0,1 мл-, растворы 1,0 н. СН3СООН и
Немного теорий в истории химии завладело умами современников с такой быстротой, как теория электролитической диссоциации, возникновение и утверждение которой связано с именами Аррениуса, Вант-Гоффа и Оствальда. Одно из самых загадочных явлений — способность растворов электролитов проводить электрический ток — не только получило естественное и наглядное объяснение, но и (как раз это, пожалуй, впечатляло более всего) было объяснено количественно. Был предложен ряд хорошо согласующихся друг с другом методов определения степени и констант электролитической диссоциации (кондуктометри-ческий, криоскопический, эбуллиоскопический) . В частности, криоскопический метод позволил исследовать такие свойства растворов, о которых до его создания даже не предполагали. Недаром на рубеже XIX и XX веков Аррениус, имея в виду всеобщее увлечение химиков измерениями температур замерзания, с нескрываемым удовлетворением шутил В Европе снова наступил ледниковый период .
В настоящее время известно, что это совпадение, которое убедило многих ученых в правильности теории Аррениуса, было в значительной мере случайным метод определения степени диссоциации по электропроводности неприменим к растворам солей, и эти растворы во всяком случае не подчиняются уравнению состояния идеальных газов. Тем не менее теория электролитической диссоциации с некоторыми видоизменениями является в настоящее время общепризнанной. Считается, что при растворении вещество, способное образовывать проводящий раствор в данном растворителе, самопроизвольно диссоциирует на ионы. Если растворенное вещество представляет собой соль, сильную кислоту или сильное основание, оно диссоциирует во многих случаях почти нацело при условии, что раствор не является слищком концентрированным ещества, сильно диссоциирующие и дающие с водой хорошо проводящие растворы, называются сильными электролитами Слабые кислоты и основания, например амины, фенолы, большинство органических кислот, некоторые неорганические кислоты и основания, в том числе синильная кислота и гидрат окиси аммония, а также некоторые соли, например хлорная и цианистая ртуть, диссоциированы дри обычных концентрациях лишь в незначительной TeneHH.L9TH вещества представляют собой слабые электролиты = С Соли слабых кислот и сильных оснований или слабых
В табл. 10 приведено несколько примеров лодобных расхождений в величинах степени диссоциации сильных электролитов, определенных различными методами. В теории электролитической диссоциации обосновано научное значение понятия степени диссоциации. [c.79]
Аррениус исследовал область электрохимии разбавленных растворов И открыл механизм перехода электрической энергии в химическую и обратно в итоге родилась теория электролитической диссоциации (1885—1887). Главная ценность этой теории заключалась в том, чот она, дополняя наши знания о химических процессах, по-новому осветила реакции, происходящие между электролитами в водных растворах. Но теория Аррениуса не была последним словом науки, как думали многие физики и химики. Более тщательное и встестороннее изучение растворов показало, что теория электролитической диссоциации неприменима к растворам наиболее типичных электролитов, т. е. тех, для которых L близко к 1. Аррениус ввел величину, являющуюся мерой диссоциации, которая в настоящее время называется степенью диссоциации. Электролиты, для которых L близко к 1, получили название сильных электролитов. Теория Аррениуса неприменима к ним по двум причинам во-первых, они не подчиняются закону разведения, во-вторых, определения, произведенные различными методами, дают несовпадающие результаты. [c.259]
Действительно, электропроводность растворов зависит не только от числа ионов, но и от скорости их движения при электролизе. Одно и то же количество ионов перенесет тем меньше электричества, чем. медленнее эти ионы движутся. Скорость же движения ионов должна уменьшаться вследствие тормозящего действия междуионных сил притяжения и отталкивания. Влияния этих сил классическая теория электролитической диссоциации не учитывает, что вносит известную погрешность в результаты определения степени диссоциации указанньп и выше методами. Величина погрешности оказывается, однако, весьма различной для слабых и сильных электролитов./ В случае слабых электролитов с ней можно не считаться, поскольку они образуют весьма мало ионов, находящихся так далеко друг от друга, что междуионные силы практически роли не играют. Сильные электролиты образуют при диссоциации очень шого ионов, которые в не слишком разбавленных растворах находятся настолько близко друг к другу, что влияние междуионных сил на скорость их движения оказывается значнтельны.м. Следовательно, не считаться с междуион-ными силами уже нельзя. Поскольку же при определении и влияние этих сил во внимание не принимается, а вызываемое ими понижение электропроводности раствора приписывается неполной диссоциации электролита, получаются неправильные, пониженные значения степени диссоциации, которая для сильных электролитов поэтому и называется кажущейся степенью диссоциации. [c.37]
Методы определения Ц2 в условиях электролитической диссоциации исследуемых веществ предложены в ряде работ [38, 49, 50]. Методика, предложенная авторами работ [49, 50], основана на совместном определении зависимости статической диэлектрической проницаемости и удельной (х) и эквивалентной (> ) электропроводности одних и тех же растворов от концентрации растворенного вещества Со (моль/л). С применением обычно используемых методов обработки данных по электропроводности растворов, исходя из экспериментально найденных зависимостей X — Сд, рассчитывают константы электролитической диссоциации Кц и предельные эквивалентные электропроводности по значениям которых определяют степень диссоциации у и концентрацию непродиссоциировавшей части исследуемого вещества С = = Со(1-у). [c.157]
Первые кинетические исследования некоторых каталитических реакций, таких, как гидролиз эфиров и инверсия сахара (Аррениус Оствальд, после 1890 г.), указали на существование соотношения между скоростью реакции и силой кислоты, примененной в качестве катализатора. В.соответствии с теорией электролитической диссоциации каталитическое действие кислот приписывалось исключительно водородным ионам, а в случае основного катализа — гидроксильным ионам раствора. Анионам кислот, соответственно катионам оснований, применяемым в качестве катализаторов, не приписывали никакого каталитического действия. Концентрацию водородных и гидроксильных ионов измеряли, как правило, методом электропроводности. Однако вскоре было замечено, что только в некоторых случаях и в определенных условиях скорость реакции является линейной функцией концентрации гидроксильных или водородных (т.е. гидроксониевых) ионов, измеренной кондуктометрическим путем. Главным образом в случае сильных кислот рост стехиометрической концентрации кислоты всегда обусловливает значительно большее увеличение скорости реакции, чем степени диссоциации , вычисленной из электропроводности раствора. Было также замечено, что прибавление нейтральных солей, т.е. солей, не являющихся кислыми илн основными и не обладающих общим с кислотами ионом, иногда значительно изменяет скорость реакции (солевые эффекты). [c.221]
Электролитическая диссоциация, свойство водных растворов проводить электрический ток
Купить рН-метры, pH meters в Санкт-Петербурге
В каталоге товаров/продукции представлены рН-метры — pH метры Россия, карманные рН-метры, портативные рН-метры, стационарные рН-метры, рН-метры для пищевой промышленности, категории: pH meter made in Russia, pocket pH meters, portable pH meters, stationary pH meters, pH meters for food industry, ; портативные, стационарные лабораторные модели измерителей водородного показателя (показателя pH), компактные карманные приборы рН-метры, автономные портативные рН-метры для оперативного определения кислотности или щелочности среды, лабораторные модели стационарные измерители водородного показателя (показателя pH), ,pH метры Россия
Подробнее… Купить pH метры производства Россия — pH meter made in Russia в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Купить портативные, стационарные pH метры Россия в Санкт-Петербурге по выгодной цене. компактные модели рН-метров, приборов для измерения водородного показателя.карманные рН-метры
Подробнее… Купить карманные рН-метры — pocket pH meters в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Легкие и удобные устройства предназначены для оперативного определения кислотности или щелочности среды / определения уровня pH среды в полевых условиях, когда использование более громоздких лабораторных «портативных рН-метров»; «стационарных рН-метров» приборов зат…рН-метры для пищевой промышленности
Подробнее… Приборы для анализа пищевых продуктов — купить рН-метры для пищевой промышленности — pH meters for food industry в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Универсальные измерительные приборы контроля качества продуктов питания применяются в различных лабораториях и производстве. Купить прибор в Санкт-Петербурге по выгодной цене. рН-метры. В каталоге ХИМСНАБ-СПБ представлены…Купить электроды для измерения pH, анализаторы pH-электроды для рН-метров
Выносные электроды предназначеных для проведения измерений в лабораторных и полевых измерений рН, определения окислительно-восстановительного потенциала, удельной электрической проводимости и температуры воды, водных растворов. Анализаторы состоят из измерительного преобразователя и комбинированных датчиков (первичных преобразователей), обеспечивающих измерение параметров водной среды. Измерительные приборы отличает высокая производительность и точность осуществляемых измерений.
Купить электроды и датчики, electrodes and sensors в Санкт-Петербурге
В каталоге товаров/продукции представлены электроды и датчики — Ион-селективные электроды, pH-электроды, электроды для измерения pH, датчики ОВП, редокс-электроды, датчики проводимости, датчики температуры, кислородные датчики, электроды вспомогательные (сравнения), категории: Ion-selective electrodes, pH-electrodes, sensors ORP, conductivity sensors, temperature sensors, oxygen sensors, the auxiliary electrode (comparison), ; Ион-селективные электроды, pH-электрод, датчики ph, электрод ph метра, электроды для измерения ph, измерительный электрод ph, рН-метрический электрод, измерение значения концентрации ионов водорода, определение концентрации ионов водорода, электроды датчики ОВП, редокс-электроды, измерение окислительно-восстановительного потенциала, многодиапазонные зонды и электроды, электроды датчики проводимости, электрод сенсор датчик температуры, электрод сенсор датчик кислородный, специальные лабораторные и промышленные электроды сравнения, электроды вспомогательные,Ион-селективные электроды
Подробнее… Купить Ион-селективные электроды — Ion-selective electrodes в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Купить Ион-селективный электрод в Санкт-Петербурге по выгодной цене. Проведение лабораторных ионометрических исследований, ионометрический анализ образцов требует наличия анализаторов и специализированного лабораторного оборудования: ионоселективного электрода, вспомогательного…pH-электроды, электроды для измерения pH
Подробнее… Купить pH-электроды (pH-electrodes) лабораторные измерительные устройства, анализаторы жидкости, растворов, воды и водных сред используемые для получения точных и воспроизводимых показаний приборов, опредлеление кислотности или щелочности выраженной в виде pH. В комании ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93 можно приобрести рН-электроды для рН-метров, анализаторов воды предназначе…датчики ОВП, редокс-электроды
Подробнее… Индикаторные элементы для проведения измерения окислительно-восстановительных потенциалов. В обратимых окислительно-восстановительных системах позволяют проводить определение концентрации компонентов. Специализированные электроды и датчики ОВП, редокс-электроды имеют особые электрохимические характеристики для потенциометрических измерений, регистрации ОВП растворов. Измерительное оборудован…датчики проводимости
Подробнее… Купить многодиапазонные датчики проводимости — conductivity sensors для кондуктометров использующих выносной (сменный) электрод в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Купить датчик проводимости в Санкт-Петербурге по выгодной цене. Специализированные электроды и датчики, electrodes and sensors с подключаемым кабелем используемые для определения проводимости и солесодержания в вод…кислородные датчики
Подробнее… Купить кислородные датчики — oxygen sensors для стационарных и портативных оксиметров в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Модели стандартных полярографических датчиков растворенного кислорода применяемых в настольных и портативных приборах. Отдельные модели датчиков кислорода состоят из платинового катода, серебряного анода и фторопластовой мембраны. Конструкции датчика делаю…электроды вспомогательные (сравнения)
Подробнее… Купить электроды вспомогательные (сравнения) — auxiliary electrode (comparison) в ХИМСНАБ-СПБ, контактный телефон +7-812-337-18-93. Лабораторный вспомогательный или опорный электрод, заполненный концентрированным раствором КСl — электролит является вторым по значимости элементом измерительного прибора «рН-метра» . Данный тип электрода позволяет создать опорную точку, относитель… индикаторная бумага в ПОЛОСКАХ или индикаторная бумага в КАТУШКАХ. Подобрать по диапазону pH: 0 — 6 рН; 1 — 12 рН; 4,5 — 10 рН; 7 — 14 рН; 1 — 11 рН; 5,5 — 9 рН; 1 — 14 рН; 0 — 14 рН; 0 — 12 рН, также в каталоге ХИМСНАБ-СПБ лабораторного оборудования и приборов, раздела измерительные приборы можно приобрести приборы для измерения водородного показателя pH: «рН-метры»; «карманные рН-метры»; «портативные рН-метры»; «стационарные рН-метры» и «pH-электроды» Оставьте заявку ON-LINE или позвоните. Менеджер компании ответит на ваши вопросы.Широкий ассортимент
В каталоге компании более 4000 наименований продукции в 200 товарных категориях: химические реактивы, лаб. оборудование и посуда, аксессуары и принадлежности для лабораторий, различные виды удобрений, химическое сырьеи многе другое. Можно подобрать продукцию воспользовавшись фильтром характеристик.
Проверенные поставщики
Компания реализует товары и продукцию только от проверенных поставщиков гарантирующих качестно продукции.
Консультация по продукции
Менеджеры компании проконсультируют вас по ассортименту реализуемой продукции, звоните в рабочее время
Доставка
География потребителей выходит за пределы России, компания «Химснаб-СПБ» осуществляет доставку приобретаемых товаров и продукции по Санкт-Петербургу, Ленинрадской обл, России и странам СНГ.
Индивидуальный подход
Строим свое сотрудничество с клиентом с учетом всех пожеланий клиента. Гибкий и индивидуальный подход к каждому клиенту, ориентированность на долгосрочные партнерские отношения, строгое соблюдение оговоренных сроков и предоставления документов заказчику являются неоспоримыми преимуществами компании «Химснаб-СПБ». Мы заботимся о том, чтобы каждый наш клиент остался доволен приобретаемой продукцией и полученным результатом, который является нашим общим успехом!
Малотоннажная химия
Реализация продукции малотоннажной химии: продукция химической и нефтехимической промышленности. Малотоннажная химия дает возможность на скромном оборудовании и в небольших объемах производить дорогостоящие модификаторы, пластификаторы, ингибиторы и другие микродобавки, способные наделять конечный продукт новыми свойствами
Комплексное снабжение, оснащение
Компания Химснаб-СПБ имеет многолетний опыт работы на рынке химической продукции и лабораторного оборудования. Компания тесно сотрудничает со многими промышленными и производственными организациями и имеет возможность осуществлять комплексное снабжение и оснащение предприятии различных отраслений промышленности необходимым оборудованием и расходными материалами.
Предствленная информация на страницах данного интернет-сайта и в каталоге продукции носит исключительно информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями Статьи 437 (2) Гражданского кодекса РФ. Для получения подробной информации о наличии и стоимости указанных товаров и (или) услуг,обращайтесь к менеджерам отдела продаж: форма обратной связи, e-mail, телефон.
Реализация продукции для сельского хозяйства, химической, строительной, нефтегазовой, металлургической, текстильной, кожевенной, и других отраслей промышленности.
Первичные культуры опухолевых клеток: современные методы получения и поддержания in vitro | Межевова
1. Фрешни Р. Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. Перевод с 5 — го английского издания. Москва: Бином. Лаборатория знаний, 2011.
2. Leithner K, Wohlkoenig C, Stacher E, Lindenmann J, Hofmann NA, Gallé B, et al. Hypoxia increases membrane metallo- endopeptidase expression in a novel lung cancer ex vivo model — role of tumor stroma cells. BMC Cancer. 2014 Jan 25;14:40. https://doi.org/10.1186/1471–2407–14–40
3. Hanahan D, Coussens LM. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 2012 Mar 20;21(3):309–322. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2012.02.022
4. Shibue T, Weinberg RA. EMT, CSCs, and drug resistance: the mechanistic link and clinical implications. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Oct;14(10):611–629. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2017.44
5. Hirata E, Sahai E. Tumor Microenvironment and Differential Responses to Therapy. Cold Spring Harb Perspect Med. 2017 Jul 5;7(7). https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026781
6. Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347–354. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2013.03.006
7. Li W-C, Ralphs KL, Tosh D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 2010;633:185–196. https://doi.org/10.1007/978–1–59745–019–5_13
8. Janik K, Popeda M, Peciak J, Rosiak K, Smolarz M, Treda C, et al. Efficient and simple approach to in vitro culture of primary epithelial cancer cells. Biosci Rep. 2016;36(6). https://doi.org/10.1042/BSR20160208
9. Volovitz I, Shapira N, Ezer H, Gafni A, Lustgarten M, Alter T, et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single- cells. BMC Neurosci. 2016 Jun 1;17(1):30. https://doi.org/10.1186/s12868–016–0262-y
10. Skog M, Sivlér P, Steinvall I, Aili D, Sjöberg F, Elmasry M. The Effect of Enzymatic Digestion on Cultured Epithelial Autografts. Cell Transplant. 2019;28(5):638–644. https://doi.org/10.1177/0963689719833305
11. Nishikata T, Ishikawa M, Matsuyama T, Takamatsu K, Fukuhara T, Konishi Y. Primary culture of breast cancer: a model system for epithelial- mesenchymal transition and cancer stem cells. Anticancer Res. 2013 Jul;33(7):2867–2874.
12. Spaethling JM, Na Y-J, Lee J, Ulyanova AV, Baltuch GH, Bell TJ, et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Rep. 2017 17;18(3):791–803. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.066
13. Mederacke I, Dapito DH, Affò S, Uchinami H, Schwabe RF. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nat Protoc. 2015 Feb;10(2):305–315. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.017
14. Castell JV, Gómez- Lechón MJ. Liver cell culture techniques. Methods Mol Biol. 2009;481:35–46. https://doi.org/10.1007/978–1–59745–201–4_4
15. Ribatti D. A milestone in the study of the vascular system: Wilhelm Roux’s doctoral thesis on the bifurcation of blood vessels. Haematologica. 2002 Jul;87(7):677–678.
16. Damm G, Schicht G, Zimmermann A, Rennert C, Fischer N, Kießig M, et al. Effect of glucose and insulin supplementation on the isolation of primary human hepatocytes. EXCLI J. 2019;18:1071–1091. https://doi.org/10.17179/excli2019–1782
17. Trojaneck B, Niemitz S, Micka B, Lefterova P, Blasczyk R, Scheffold C, et al. Establishment and characterization of colon carcinoma and renal cell carcinoma primary cultures. Cancer Biother Radiopharm. 2000 Apr;15(2):169–174. https://doi.org/10.1089/cbr.2000.15.169
18. Krbala L, Soukup J, Stanislav J, Hanusova V. Derivation and basic characterization of colorectal carcinoma primary cell lines. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2017 Dec;161(4):360–368. https://doi.org/10.5507/bp.2017.040
19. Cunningham RE. Tissue disaggregation. Methods Mol. Biol. 2010;588:327–330. https://doi.org/10.1007/978–1–59745–324–0_32
20. Skarkova V, Krupova M, Vitovcova B, Skarka A, Kasparova P, Krupa P, et al. The Evaluation of Glioblastoma Cell Dissociation and Its Influence on Its Behavior. Int J Mol Sci. 2019 Sep 18;20(18):4630. https://doi.org/10.3390/ijms20184630
21. Qiu X, De Jesus J, Pennell M, Troiani M, Haun JB. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 2015 Jan 7;15(1):339–350. https://doi.org/10.1039/c4lc01126k
22. Kar R, Chawla D, Gupta B, Mehndiratta M, Wadhwa N, Agarwal R. Establishment of Primary Cell Culture From Ascitic Fluid and Solid Tumor Obtained From Epithelial Ovarian Carcinoma Patients. Int J Gynecol Cancer. 2017;27(9):20002005. https://doi.org/10.1097/igc.0000000000001087
23. Филиппова С.Ю., Ситковская А.О., Сагакянц А.Б., Бондаренко Е.С., Ващенко Л.Н., Кечеджиева Э.Э. и др. Выделение опухолевых стволовых клеток рака молочной железы с применением коллагеназы. Современные проблемы науки и образования. 2019;6:147.
24. Межевова И.В., Ситковская А.О., Росторгуев Э.Е., Филиппова С.Ю., Нистратова О.В., Кузнецова Н.С. и др. Нейрохирургический подход для получения первичных клеточных линий глиальных опухолей. Исследования и практика в медицине. 2019;6(S):191.
25. Kapałczyńska M, Kolenda T, Przybyła W, Zajączkowska M, Teresiak A, Filas V, et al. 2D and 3D cell cultures — a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018 Jun;14(4):910–919. https://doi.org/10.5114/aoms.2016.63743
26. Burdett E, Kasper FK, Mikos AG, Ludwig JA. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 2010 Jun;16(3):351–359. https://doi.org/10.1089/ten.teb.2009.0676
27. Sant S, Johnston PA. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discov Today Technol. 2017 Mar;23:27–36. https://doi.org/10.1016/j.ddtec.2017.03.002
28. Jørgensen A, Young J, Nielsen JE, Joensen UN, Toft BG, Rajpert- De Meyts E, et al. Hanging drop cultures of human testis and testis cancer samples: a model used to investigate activin treatment effects in a preserved niche. Br J Cancer. 2014 May 13;110(10):2604–2014. https://doi.org/10.1038/bjc.2014.160
29. Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 2011 May 6;(51). https://doi.org/10.3791/2720
30. Jeppesen M, Hagel G, Glenthoj A, Vainer B, Ibsen P, Harling H, et al. Short-term spheroid culture of primary colorectal cancer cells as an in vitro model for personalizing cancer medicine. PLoS ONE. 2017;12(9): e0183074. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183074
31. Ahmad A. Breast Cancer Metastasis and Drug Resistance. Challenges and Progress. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019;1115:1–7. https://doi.org/10.1007/978–3–030–20301–6
32. Lombardo Y, de Giorgio A, Coombes CR, Stebbing J, Castellano L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. J Vis Exp. 2015 Mar 22;(97): 52671. https://doi.org/10.3791/52671
33. Hoffmann O, Ditsch N, Ahne M, Arnold F, Paepke S, et al. Testing chemotherapy efficacy in HER2 negative breast cancer using patient- derived spheroids. J Transl Med. 2016;14(1):112. https://doi.org/10.1186/s12967–016–0855–3
34. Qureshi- Baig K, Ullmann P, Rodriguez F, Frasquilho S, Nazarov PV, Haan S, et al. What Do We Learn from Spheroid Culture Systems? Insights from Tumorspheres Derived from Primary Colon Cancer Tissue. PLoS ONE. 2016;11(1): e0146052. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146052
35. Weiswald L-B, Bellet D, Dangles- Marie V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 2015 Jan;17(1):1–15. https://doi.org/10.1016/j.neo.2014.12.004
36. Jaganathan H, Gage J, Leonard F, Srinivasan S, Souza GR, Dave B, et al. Three-dimensional in vitro co-culture model of breast tumor using magnetic levitation. Sci Rep. 2014 Oct 1;4:6468. https://doi.org/10.1038/srep06468
37. Hoarau- Véchot J, Rafii A, Touboul C, Pasquier J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer- Microenvironment Interactions? Int J Mol Sci. 2018 Jan 18;19(1):181. https://doi.org/10.3390/ijms19010181
38. Kleinman HK, Martin GR. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 2005 Oct;15(5):378–386. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2005.05.004
39. Doyle AD, Carvajal N, Jin A, Matsumoto K, Yamada KM. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility- dependent adhesions. Nat Commun. 2015 Nov 9;6:8720. https://doi.org/10.1038/ncomms9720
40. Tibbitt MW, Anseth KS. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 2009 Jul 1;103(4):655–663. https://doi.org/10.1002/bit.22361
41. Tokuda EY, Jones CE, Anseth KS. PEG-peptide hydrogels reveal differential effects of matrix microenvironmental cues on melanoma drug sensitivity. Integr Biol (Camb). 2017 23;9(1):76–87. https://doi.org/10.1039/c6ib00229c
42. Yu M, Jambhrunkar S, Thorn P, Chen J, Gu W, Yu C. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44 — overexpressing cancer cells. Nanoscale. 2013 Jan 7;5(1):178–183. https://doi.org/10.1039/c2nr32145a
43. De T, Goyal S, Balachander G, Chatterjee K, Kumar P, Babu K G, et al. A Novel Ex Vivo System Using 3D Polymer Scaffold to Culture Circulating Tumor Cells from Breast Cancer Patients Exhibits Dynamic E-M Phenotypes. J Clin Med. 2019 Sep 16;8(9):1473. https://doi.org/10.3390/jcm8091473
44. Nayak B, Balachander GM, Manjunath S, Rangarajan A, Chatterjee K. Tissue mimetic 3D scaffold for breast tumorderived organoid culture toward personalized chemotherapy. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019 Aug 1;180:334–343. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2019.04.056
45. Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol Ther. 2016;163:94–108. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2016.03.013
46. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006 Jul 27;442(7101):368–373. https://doi.org/10.1038/nature05058
47. Ataç B, Wagner I, Horland R, Lauster R, Marx U, Tonevitsky AG, et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab Chip. 2013 Sep 21;13(18):3555–3561. https://doi.org/10.1039/c3lc50227a
48. Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ- level lung functions on a chip. Science. 2010 Jun 25;328(5986):1662–1668. https://doi.org/10.1126/science.1188302
49. Powers MJ, Domansky K, Kaazempur- Mofrad MR, Kalezi A, Capitano A, Upadhyaya A, et al. A microfabricated array bioreactor for perfused 3D liver culture. Biotechnol Bioeng. 2002 May 5;78(3):257–269. https://doi.org/10.1002/bit.10143
50. Kimura H, Yamamoto T, Sakai H, Sakai Y, Fujii T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab Chip. 2008 May;8(5):741–746. https://doi.org/10.1039/b717091b
51. Patra B, Peng C–C, Liao W-H, Lee C-H, Tung Y-C. Drug testing and flow cytometry analysis on a large number of uniform sized tumor spheroids using a microfluidic device. Sci Rep. 2016 Feb 15;6:21061. https://doi.org/10.1038/srep21061
52. Shwetha HR, Kotrashetti VS, Babu NC, Kumbar V, Bhat K, Reddy R. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. J Oral Maxillofac Pathol. 2019 Aug;23(2):243–247. https://doi.org/10.4103/jomfp.JOMFP_105_19
53. Goldman A, Khiste S, Freinkman E, Dhawan A, Majumder B, Mondal J, et al. Targeting tumor phenotypic plasticity and metabolic remodeling in adaptive cross-drug tolerance. Sci Signal. 2019 20;12(595). https://doi.org/10.1126/scisignal.aas8779
54. Baird JR, Bell RB, Troesch V, Friedman D, Bambina S, Kramer G, et al. Evaluation of Explant Responses to STING Ligands: Personalized Immunosurgical Therapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Res. 2018 01;78(21):6308–6319. https://doi.org/10.1158/0008–5472.can-18–1652
55. Muff R, Botter SM, Husmann K, Tchinda J, Selvam P, SeeliMaduz F, et al. Explant culture of sarcoma patients’ tissue. Lab Invest. 2016;96(7):752–762. https://doi.org/10.1038/labinvest.2016.49
56. Mutuku SM, Trim PJ, Prabhala BK, Irani S, Bremert KL, Logan JM, et al. Evaluation of Small Molecule Drug Uptake in Patient- Derived Prostate Cancer Explants by Mass Spectrometry. Sci Rep. 2019 18;9(1):15008. https://doi.org/10.1038/s41598–019–51549–3
57. Centenera MM, Hickey TE, Jindal S, Ryan NK, Ravindranathan P, Mohammed H, et al. A patient- derived explant (PDE) model of hormone- dependent cancer. Mol Oncol. 2018;12(9):16081622. https://doi.org/10.1002/1878–0261.12354
58. Ricciardelli C, Lokman NA, Sabit I, Gunasegaran K, Bonner WM, Pyragius CE, et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. 155
УДК 675.015.22:616.511
А.К. ШЕРСТЕННИКОВА, С.Л. КАШУТИН, Л.М. ЖУРАВЛЁВ, В.С. НЕКЛЮДОВА, Е.И. ТЕДДЕР
Северный государственный медицинский университет МЗ РФ, 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, д. 51
Получение изолированных клеток эпидермиса и дермы посредством метода клеточно-щелочной диссоциации
Шерстенникова Александра Константиновна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной физиологии, тел. +7-911-555-23-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-8576-6459 Кашутин Сергей Леонидович — доктор медицинских наук, заведующий кафедрой кожных и венерических болезней, тел. +7-906-281-23-90, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-2687-3059
Журавлев Леонид Михайлович — ординатор кафедры хирургии, тел. +7-952-306-09-96, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-2655-9649
Неклюдова Виктория Сергеевна — ассистент кафедры кожных и венерических болезней, тел. +7-911-878-70-80, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-6669-2992
Теддер Елена Игоревна — ассистент кафедры кожных и венерических болезней, тел. +7-911-572-72-82, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-0801-6181
цель работы — обоснование применения метода, позволяющего получить изолированные клетки дермы и эпидермиса для дальнейшей их идентификации.
Материал и методы. Методика клеточно-щелочной диссоциации клеток кожи в модифицированном варианте проводилась в соответствии с предложенным Л.М. Журавлевым и соавт. патентом РФ 2617237 «Способ получения препаратов изолированных клеток дермы».
Результаты. На примере сравнительного анализа гистологических срезов псориатической папулы, келлоидного рубца, среза папулы при угревой болезни и результатов клеточно-щелочной диссоциации аналогичных биоптатов были показаны возможности использования клеточно-щелочной диссоциации в дерматологии.
Заключение. Использование метода клеточно-щелочной диссоциации позволяет получить информацию относительно изолированных клеточных элементов эпидермиса и дермы, в том числе гемопоэтического происхождения, степень дифференцировки кератиноцитов с учетом их митотической активности, что не удается достичь при исследовании гистологических срезов.
Ключевые слова: изолированные клетки, эпидермис, дерма.
DOI: 10.32000/2072-1757-2018-16-6-155-158
(Для цитирования: Шерстенникова А.К., Кашутин С.Л., Журавлев Л.М., Неклюдова В.С., Теддер Е.И. Получение изолированных клеток эпидермиса и дермы посредством метода клеточно-щелочной диссоциации. Практическая медицина. 2018. Том 16, № 6, С. 155-158)
A.K. SHERSTENIKOVA, S.L. KASHUTIN, L.M. ZHURAVLEV, V.S. NEKLYUDOBA, E.I. TEDDER
Northern State Medical University of the MH of RF, 51 Troitskiy prospekt, 163000 Arkhangelsk, Russian Federation
Obtaining isolated cells of epidermis
and derma by method of cellular alkaline dissociation
Sherstennikova A.K. — PhD (medicine), Associate Professor of the Normal Physiology Department, tel. +7-911-555-23-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-8576-6459
Kashutin S.L. — D. Sc. (medicine), Head of the Skin and Venereal Diseases Department, tel. +7-906-281-23-90, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-2687-3059
Zhuravlev L.M. — resident of the Surgery Department, tel.: +7-952-306-09-96, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-2655-9649 Neklyudova V.S. — Assistant Lecturer of the Skin and Venereal Diseases Department, tel.: +7-911-878-70-80, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0001-6669-2992
Tedder E.I. — Assistant Lecturer of the Skin and Venereal Diseases Department, tel. +7-911-572-72-82, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-0801-6181
OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
Objective. To substantiate application of the method to obtain isolated cells of the dermis and epidermis for their further identification.
Materials and methods. The technique of cell-alkaline dissociation of skin cells in the modified version was carried out in accordance with the patent of the Russian Federation 2617237″Method of obtaining preparations of isolated cells of the dermis» proposed by L.M. Zhuravlev et al.
Results. Using the comparative analysis of microscopic sections of psoriatic papules, keloid scar, slice of acne papules and the results of alkaline dissociation of corresponding bioptates, the possibilities of using cell-base dissociation in dermatology were shown.
Conclusions. The use of alkaline dissociation method allows obtaining information on the isolated cellular elements of the epidermis and dermis, including hematopoietic origin, degree of differentiation of keratinocytes based on their mitotic activity, which is not possible to achieve in the study of microscopic sections.
Key words: isolated cells, epidermis, dermis.
(For citation: Sherstennikova A.K., Kashutin S.L., Zhuravlev L.M., Neklyudova V.S., Tedder E.I. Obtaining isolated cells of epidermis and derma by method of cellular alkaline dissociation. Practical Medicine. 2018. Vol. 16, no 6, P. 155-158)
Введение
Известно, что гистологические срезы кожи позволяют визуально определить наличие патомор-фологических изменений, связанных с нарушением эпидермальной кинетики, дифференцировки кера-тиноцитов и эпидермальных связей, воспалительными и дистрофическими процессами в дерме. При этом цитометрические характеристики клеточных элементов эпидермиса и дермы необходимо осуществлять на изолированных клетках, что на гистологическом срезе реализовать не представляется возможным [1]. С другой стороны, существуют методы определения иммуногистохимическим путем процентного содержания клеток, экспрессирующих тот или иной рецептор. Однако в ряде случаев аналогичный рецептор может быть выявлен на различных клетках, что также исключает возможность идентификации клетки [2, 3, 4, 5].
Рисунок 1
Клеточные элементы эпидермиса и дермы после клеточно-щелочной диссоциации: К — ке-ратиноцит; М — миоциты; Ф — фибробласт; Л — лимфоцит; Н — нейтрофил; Кв — колла-геновые волокна. Гематоксилин-эозин. 06.40, ок.10 Figure 1
Cell elements of epidermis and derma after cellular-alkaline dissociation: K — keratinocyte; M — myocytes; F — fibroblast; L — lymphocyte; N — neutrophil; Cf — collagen fibers. Hematoxyilin — eosin. Vol. 40, oc. 10
АКУШЕРСТВО И ГИНЕКОЛОГИЯ
Ранее для получения изолированных клеток тканей Л.Н. Белов, М.Е. Коган и др. предложили метод клеточно-щелочной диссоциации [6, 7]. Однако для получения изолированных клеток дермы и эпидермиса он оказался малоэффективным. В дальнейшем этот метод был модифицирован и адаптирован для изучения клеточных элементов кожи Л.М. Журавлевым и соавт. [8]. С учетом вышесказанного актуальным является обоснование применения метода, позволяющего получить изолированные клетки дермы и эпидермиса с целью дальнейшей их идентификации.
Материалы и методы
Проводили цитологическое исследование 105 биоптатов кожи, из которых 25 биоптатов была
Рисунок 2
Клеточные элементы эпидермиса и дермы после клеточно-щелочной диссоциации био-птата папулы при псориазе: К — кератиноцит; Э — эндотелиоцит; Л — лимфоциты. Гематоксилин-эозин. 06.40, ок.10 Figure 2
Cell elements of epidermis and derma after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in psoriasis: K — keratinocyte; E — endoteliocyte; L — lymphocytes. 157
кожа лиц, не имеющих хронической патологии в анамнезе, в том числе кожной, 22 биоптата псориа-тической папулы в прогрессирующую и стационарную стадии, 20 биоптатов келлоидных рубцов и по 19 биоптатов папул угревой болезни и васкулитов.
Забор биоптата здоровой кожи, псориатических папул проводили на передней стенке живота, при угревой болезни папулы локализовались на спине, при васкулитах — на передней поверхности голеней. Кусочки кожи брали панч-скальпелем №5 после инфильтрационной анестезии 2 % лидокаином с соблюдением правил асептики и антисептики. Келлоидная ткань была получена в результате хирургического иссечения келлоидных рубцов в абдоминальной области.
Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 года с изменениями и дополнениями на 2008 год).
В ходе исследования использовали методику клеточно-щелочной диссоциации клеток кожи, в модифицированном варианте проводилась в соответствии с предложенным Л.М. Журавлевым и со-авт. патентом РФ 2617237 «Способ получения препаратов изолированных клеток дермы» [8].
Результаты исследования
Методика клеточно-щелочной диссоциации (рис. 1) позволяет получить изолированные клетки эпидермиса и дермы: кератиноциты, миоциты, фи-бробласты, лимфоциты, нейтрофилы, а также кол-лагеновые волокна.
На гистологических срезах псориатической папулы хорошо визуализируется гиперкератоз с па-
ракератозом и акантоз с папилломатозом, а также лимфо-гистиоцитарные инфильтраты в сосочковой и сетчатой дерме. Однако данный срез не дает возможности идентифицировать лимфоидные элементы и т. п. Напротив, в результате проведения метода клеточно-щелочной диссоциации биоптата псориатической папулы определяются наряду с ке-ратиноцитами лимфоциты, эндотелиоциты, фибро-бласты (рис. 2). Посредством предлагаемого метода достигается возможность не только оценить степень дифференцировки кератиноцитов, но и учитывать митотическую активность кератиноцитов: двуядер-ные кератиноциты показаны на рис. 3. Учитывая то, что лимфоидные элементы могут иметь различный фенотип и по морфологическим признакам не всегда удается отличить их от макрофагов и фи-бробластов, необходима дальнейшая идентификация рецепторного аппарата клеток путем непрямой иммунопероксидазной реакции с моноклональными антителами методом «высушенной капли». Ценность представленного метода определяется еще и тем, что для исследования становятся доступными изолированные эндотелиоциты. Сведения о роли этих клеток в патогенезе псориаза довольно противоречивы, хотя именно эндотелиальные клетки участвуют в роллинге, прочной адгезии и трансмиграции непосредственных участников патогенеза псориаза — нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. От эндо-телиоцитов зависит, насколько выраженной будет миграционная активность гемопоэтических клеток в дерму, а следовательно, насколько выраженным будет воспалительный компонент [9, 10, 11].
Келоидный рубец характеризуется наличием в дерме склероза и гиалиноза с хаотичным расположением волокон, а также скудными лимфоидными инфильтратами вокруг сосудов.
Клеточные элементы келоидного рубца, полученные в ходе клеточно-щелочной диссоциации, были
Рисунок 3
Двуядерные кератиноциты (стрелка) после клеточно-щелочной диссоциации биоптата псориатической папулы. Гематоксилин-эозин. 06.90, ок. 10 Figure 3
Two-nucleus keratinocytes (arrow) after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in psoriasis. Hematoxyilin — eosin. Vol. 90, oc. 10
Рисунок 4
Отростчатые клетки (стрелка) после клеточ-но-щелочной диссоциации биоптата папулы при угревой болезни. Гематоксилин-эозин. Об. 40, ок. 10 Figure 4
Dendritic cells (arrow) after cellular-alkaline dissociation of biopsy of a papula in acne. Hematoxyilin — eosin. Vol. 40, oc. 10
OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
представлены морфологическими аналогами фи-бробластов, лимфоидных клеток и эндотелиоцитов, причем некоторые эндотелиоциты полностью изолировать не получилось, и в поле зрения визуализировались фрагменты капилляров.
На гистологических срезах папулы при угревой болезни в эпидермисе не зарегистрированы изменения эпидермальной кинетики, однако хорошо определялась лейкоцитарная инфильтрация. В со-сочковой дерме были выраженны лейко-лимфоид-ные инфильтраты. Сальные железы были гипер-плазированы, у одной из них наблюдалось гнойное разрушение. В сетчатой дерме имелись массивные округлые очаги лейко-лимфоидной инфильтрации. Определялась дезорганизация коллагеновых волокон сосочковой и сетчатой дермы.
Проведение клеточно-щелочной диссоциации показало наличие лимфоидных элементов, фибро-бластов, кератиноцитов, нейтрофилов, остатков ядерного материала нейтрофилов, а также отрост-чатые клетки (рис. 4), которые могут относиться либо к меланоцитам, либо к клеткам Лангерганса. Безусловно, что для более точной идентификации необходимо проведение гистохимического анализа и непрямой иммунопероксидазной реакции, но факт выявления изолированных клеток несомненно представляет интерес.
Таким образом, использование метода клеточно-щелочной диссоциации позволяет получить изолированные клетки эпидермиса и дермы, в том числе гемопоэтического происхождения, с целью дальнейшей их идентификации и проведения цитоме-трического анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Цветкова Г.М., Мордовцева В.В., Вавилов А.М., Мордовцев В.Н. Патоморфология болезней кожи: Руководство для врачей. — М.: Медицина, 2003. — 496 с.
2. Волнухин В.А., Вавилов А.М., Кравцова И.В., Катунина О.Р. Гистологические и иммуногистохимические изменения кожи больных псориазом при лечении ПУВА-ваннами // Вестник дерматологии и венерологии. — 2007. — № 2. — С. 3-7.
3. Катунина О.Р., Резайкина А.В. Иммуногистохимический и морфометрический анализ содержания Толл-подобных рецепторов 2 и 4, клеток Лангерганса и субпопуляций Т-лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2012. — № 2. — С. 51-54.
4. Новиков А.И., Кононов А.В., Охлопков В.А., Правдина О.В. Иммунохимическое исследование при псориазе // Вестник дерматологии и венерологии. — 2003. — № 3. — С. 26-28.
5. Новиков А.И., Охлопков В.А., Губарева A.B. Морфологическая характеристика элементов сыпи при угревой болезни (биоп-сийное исследование) // Клиническая дерматология и венерология. — 2007. — № 2. — С. 62-67.
6. Павлов А.В., Шашкина М.В., Гансбургский М.А., и др. Получение изолированных клеток для цитологических и цитогенетиче-ских исследований эпителия щитовидной железы // Морфология.
— 2006. Т. 130. — № 6. — С. 81-83.
7. Белов Л.Н., Коган М.Е., Леонтьева Т.А., и др. Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей // Цитология. — 1975. — №17(11). — С. 1332-1338.
8. Журавлёв Л. М., Вилова К. Г., Мизгирёв Д. В., Зашихин А. Л., Кашутин С. Л. Способ получения препаратов изолированных клеток дермы. Патент РФ 2617237, заявка 2015124695, 23.06.2015.
9. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. — М.: Медицина; 1995. — 224 с.
10. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука. — 2001. — 231 с.
11. Гарифуллина Э.Ф., Хисматуллина З.Р., Тухватуллина З.Г. Нарушение дифференцировки эпидермальных клеток при лимфо-пролиферативных заболеваниях кожи // Практическая медицина.
— 2012. —№ 6 (61) . — С. 106-109.
АКУШЕРСТВО И ГИНЕКОЛОГИЯ
Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry
Дифференциальная сканирующая флуориметрия продемонстрировала свою силу в качестве надежной и универсальной метода для характеристики белков, и выявления потенциальных лигандов белка. Хорошо задокументированные успехи в ускорении стабилизации белка, лекарств (особенно в менее финансируемых лабораторий) и кристаллизация 10,23-25 сделали его привлекательным методом для начального скрининга соединений. Соединения, добавленные к белкам показывают четкое зависимое от дозы увеличение кажущейся температурой плавления 7,9. Тем не менее, не было сделано попытки использовать результаты этих экспериментов, чтобы определить, кажущиеся константы связывания, чтобы помочь в рейтинге соединений на их сродство. Здесь мы представляем метод для определения систематически кажущуюся константу диссоциации белков в присутствии лиганда.
Представленные здесь результаты показывают, что DSF могут быстро и решительно дают оценки константы диссоциации дляСочетание белок-лиганд. Наблюдаемые данные можно манипулировать с коммерчески доступных инструментов, чтобы обеспечить быстрое определение Уб, без необходимости делать предположения относительно вероятной стоимости параметров. Этот метод имеет существенное преимущество по сравнению с сопоставимыми некоторых методов быть экономной в белка и времени, необходимого. Эксперимент, описанный здесь будет потреблять 0,13 мг белка на эксперименте (приблизительно 0,4 мг для экспериментов повторяются в трех экземплярах). Это выгодно отличает изотермический титрования калориметрии (ITC), где один эксперимент со средним 40 кДа белка будет потреблять такое же количество. Полный набор экспериментов, необходимых для этого протокола будет потреблять около 4 ч, в том числе подготовки, для одного набора экспериментов. Опять же, это, вероятно, будет значительно быстрее, чем методы, такие как ITC или поверхностного плазмонного резонанса, который, пока мощная часто требуют существенной оптимизации для достижения наилучших данных.
Наши результаты показывают, что остается требование, чтобы внимательно изучить исходные данные, пригодный этих данных для определения температуры плавления, и подходят данных температуры плавления, чтобы определить константу диссоциации. Первая задача заключается в форме исходных данных, полученных при плавлении белка. В некоторых случаях, форма не может приблизиться к тому, что наблюдалось на фиг.1А. Общие вопросы включают низкие сдвиги температуры на связывание лиганда, высокий фоновой флуоресценции и необычные множественные переходы температуры. Низкие сдвиги температуры наблюдаются на связывание ряд лигандов. Для этого метода, наиболее важным параметром является ошибка в измерении Т м, по сравнению со сдвигом температуры. Данные могут быть установлены, как правило, достаточно хорошо, когда стандартное отклонение трех измерений не превышает 10% от температуры плавления сдвигом между несвязанного и полностью связанного белка. Наш опыт показывает, что там, где такие температурыратуре сдвиги только 2 ° С, это может быть достаточным для подгонки данных, если отдельные точки данных с высокой точностью. Второй вопрос заключается в необычной формы кривых. Они часто отличаются от свободного белка и лиганда, связанного форм, как связывания лиганда влияет на раскрытие режимы белка. В этих случаях, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, что данные могут быть использованы с соответствующим учетом моделей, которые будут использоваться для определения температуры плавления и константу диссоциации. Еще одна распространенная проблема в том, что добавление кофактора к белку (например, MgCl 2 в нашем примере с гексокиназой) требуется для получения наиболее достоверных данных. Наш опыт показывает, что тщательное рассмотрение всех вероятных факторов в эксперименте на стадии принятия начальные показания необходимо получение наилучших результатов. Кроме того, альтернативные теоретические методы лечения могут выявить особенности этих данных 15,17. Наконец, это не редкость для некоторых белков, которые сontain изначально подвергается гидрофобные участки, чтобы показать высокий фоновой флуоресценции. Есть ряд решений этих проблем, которые были широко отзывы других 6,9.
В частности, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, чтобы использовать Больцмана или его производные модели (например, фиг.4), и в случае использования производных, независимо от того, должны быть смоделированы несколько расплавов. Эти два метода моделирования тепловой разворачивается отличаются тем, что метод Больцмана подходит экспериментальные данные для уравнения Больцмана, предполагая регулярное сигмоидального форму к разворачивающейся кривой. В отличие от этого, производное метод принимает первую производную экспериментальных данных в каждой точке (нижняя панель на фиг.1А), и считает температуру плавления, чтобы быть самой высокой точкой первой производной. Производное метод возвращает как правило, более высокую температуру плавления примерно на 2 — 3 ° С. Большинство белков вернется более последовательнымРезультат (то есть, стандартная ошибка температуры плавления для тройных опытах ниже) для одного из двух методов. Это, как правило, тесно связаны с точной формы разворачивания белка кривую, и надо эмпирически определить наилучший метод в каждом конкретном случае. Там, где используется производная модель, важно также рассмотреть несколько событий плавления. Некоторые данные ясно показывают доказательства для нескольких переходов, и в этих случаях результаты, скорее всего, будет легче определить, если эти несколько событий плавления моделируются. В контексте этого протокола, то это часто бывает, что добавление лиганда может вызвать белок перейти от наличия нескольких переходов плавления к одному перехода (например, путем стабилизации наиболее термически хрупкий субдомен), или наоборот. Поэтому мы бы посоветовали, что исходные данные рассматриваются вместе, прежде чем рассматривать, какой подход будет лучше всего использовать.
После мodelling отдельных температур плавления, дальнейшие проблемы могут возникнуть в связи с настройкой их на модели, представленные в разделе протокола. Крайне важно, чтобы внимательно изучить подгонку к константы диссоциации уравнения, используя логарифмическую шкалу, как этот анализ часто подчеркивает расхождения между данными наблюдений и модели (е .g., Рисунок 3). Хотя полученные результаты, как правило, надежные, уход в интерпретации дает возможность извлекать лучшие результаты, а самое значение, в соответствии с данными.
Особым вопросом поднят этих данных является интерпретация, что должен быть сделан на белки, которые показывают кооперативности или нескольких обязательных мероприятий, в DSF. Мы, на сегодняшний день, только наблюдали это явление в белках, которые, как ожидается, несколько специфических связывающих события (например, WCBM, белок, лучше гомолог является мультимер 26, и который выступает в качестве мультимера на гель-фильтрации [данных неПоказано]). Это не совсем понятно, что отрицательный кооперативности наблюдается в DSF денатурации указывает на то, что фермент будет в конечном счете, показывают отрицательную кооперативность: а, это может быть показателем комплекс связывания, которые должны быть изучены более детально с использованием широкого спектра методов. Это позволяет предположить, к нам, однако, что более обширные исследования таких белков, вероятно, определить интересные эффекты.
Значения, приведенные для константы диссоциации, используя этот метод, как правило, из того же порядка, предоставленные другими методами, такими как изотермический титрования калориметрии и поверхностного плазмонного резонанса. Тем не менее, абсолютные значения, наблюдаемые часто выше, чем наблюдаемые с помощью этих методов. Это, по меньшей мере, частично является следствием того факта, что константа диссоциации наблюдается при температуре плавления белка с лигандом. Это Уб как правило, выше, чем при физиологических температурах. DissociatioN константа в зависимости от температуры реакции с помощью уравнений:
[1]
[2]
(Где с θ является стандартной ссылкой концентрация, Δ гG является Гиббс изменение свободной энергии реакции, R является газовая постоянная, Δ H является изменение энтальпии в реакции, и Δ S является изменение энтропии в реакции .)
Реакции с константы диссоциации в измеряемого диапазона этого метода, как правило, имеют отрицательный Δ RG, и поэтому эффект увеличения температуры на уравнения [1] будет увеличить константу диссоциации. Оба Δ H и Δ S термины, которые составляют свободную энергию Гиббса (уравнение [2]) являются TEMPERATURе зависит 27, и эффект от константы диссоциации будет зависеть от величины и знака этих температурных зависимостей, и обязательно будет зависеть взаимодействие. Следовательно, это не является неожиданным, что константы диссоциации, определенные с помощью этого метода, иногда больше, чем те, которые определены с помощью методов, которые работают при комнатной температуре. Температурная зависимость, конечно, также предостережение многих других методов, которые, как правило, чтобы обеспечить константу диссоциации при температурах более низких, чем физиологической температуре.
Другой предостережение метода DSF является то, что меченый метод, в отличие от ITC. Флуоресцентной метки использовали (SYPRO оранжевый) является гидрофобным, и поэтому в некоторых случаях может конкурировать со связыванием гидрофобных лигандов с белками. Следовательно, вполне вероятно, что в некоторых случаях, константа диссоциации получены будет поднят искусственно вследствие конкуренции с меткой. Однако, для сравнения различных лигандов, (основное применениеDSF), различия вряд ли достаточно значимы, чтобы влиять на ранжирование соединений близостью.
Потенциальным недостатком этого способа является пределом обнаружения, что может быть достигнуто. В принципе, это не должно быть возможным точно измерить значение K D, которая ниже, чем 50% от концентрации белка, и даже значения в этом диапазоне может быть сомнительной точности. В то время как предел обнаружения на этом конце диапазона может быть продлен немного за счет снижения концентрации белка и красителя, чувствительность прибора позволит предотвратить дальнейшее снижение концентрации белка. Кроме того, верхний конец чувствительности будет определяться растворимости лиганда. Для получения математически надежную оценку для K D, очень важно, чтобы получить данные с 90% белка, присутствующего в лиганд-связанной форме, которая требует концентрации лиганда с приблизительнолы в десять раз Уб (при условии отсутствия кооперативности). Предел обнаружения будет поэтому обязательно одна десятая растворимости лиганда в соответствующем буфере. Это означает, что пределы обнаружения метода, как правило, в диапазоне от 1 мкм и от 1 до 100 мм, в зависимости от белка и лиганда.
В заключение, дифференциальная сканирующая флуориметрия является универсальным метод применим к широкому диапазону белков. Используя методы, представленные здесь, можно быстро и недорого определить сродство белка при различных лигандов. Это имеет большой потенциал для применения в очистке белков и стабилизации, выяснения функции или специфичности ферментов из метагеномов, и в разработке лекарств, особенно в небольших лабораториях.
Сродство связывания и константа равновесной диссоциации Kd
Понимание сродства связывания является ключом к оценке биологических процессов, лежащих в основе межмолекулярного взаимодействия, структурной биологии и взаимосвязи структур и функций Этот механизм также рассматривается как часть процесса открытия лекарственного препарата и помогает создавать лекарственные препараты с выборочным и специфическим связыванием с мишенью.
Сродство связывания — это сила связывания между отдельной биомолекулой (например, белка или ДНК) и ее лигандом/компонентом связывания (например, препаратом или ингибитором). Сродство связывания обычно измеряется и обозначается с использованием константы равновесной диссоциации (KD), которая применяется для оценки и ранжирования сил биомолекулярных взаимодействий. Чем ниже значение KD, тем выше сродство связывания лиганда к его молекулярной мишени. На сродство связывания оказывают влияние нековалентные межмолекулярные взаимодействия, например образование водородных связей, электростатические, гидрофобные силы и силы Ван-дер-Ваальса, возникающие между двумя молекулами.
Существует множество способов измерения сродства связывания и констант диссоциации, например ELISA, анализ задержки электрофоретического сдвига в геле, анализ аффинной адсорбции, равновесный диализ, аналитическое ультрацентрифугирование, SPR и спектроскопический анализ. Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) представляет собой прямой безмаркерный анализ, при помощи которого измеряется сродство связывания между двумя взаимодействующими друг с другом биомолекулами, например при связывании белка и лиганда. ITC измеряет значения KD в миллимолярном и наномолярном диапазоне и может определить стехиометрию связывания и параметры термодинамики связывания, необходимые для характеризации межмолекулярных взаимодействий. Этот метод называется «золотым стандартом» анализа взаимодействия молекул, поскольку он позволяет изучать широкий спектр взаимодействий и обеспечивает высокие количественные значения KD.
Диссоциация тканей — переход к стандартизированным протоколам и повышенной согласованности
Введение
Культура первичных клеток необходима для многих исследований и терапевтических применений. Чтобы получить доступ к суспензиям единичных клеток для дальнейших исследований и культивирования клеток, первым делом нужно начать с образца ткани. Затем ткань необходимо обработать для диссоциации клеток, чтобы их можно было изучить дальше. Эти первичные клетки часто используются для биомедицинских исследований, исследований клеточной биологии или для трансплантации и клеточной терапии.Эти отдельные клетки можно либо выделить в первичную культуру клеток, либо собрать вместе и переселить на вторичную культуру.
Существует три основных метода диссоциации ткани, и часто эти методы комбинируются. К ним относятся: ферментативная диссоциация, химическая диссоциация и механическая диссоциация. Ферментативная диссоциация — это процесс использования ферментов для переваривания нарезанных кусочков ткани, высвобождая клетки из ткани. В этом процессе используется много различных типов ферментов, и их также можно использовать в комбинации.Определенные ферменты более эффективны с определенными тканями, поэтому лучше всего подобрать правильный фермент или комбинацию ферментов для каждого конкретного типа ткани.
Химическая диссоциация использует тот факт, что катионы участвуют в поддержании внутриклеточных связей и внутриклеточного матрикса. При введении ЭДТА или ЭГТА, связывающего эти катионы, межклеточные связи нарушаются.
Наконец, механическая диссоциация требует разрезания, соскабливания или царапания ткани на мелкие кусочки, затем измельченную ткань промывают в среде, чтобы отделить клетки от ткани, а иногда также используется легкое перемешивание, чтобы помочь ослабить клетки.
Выбор метода диссоциации обычно производится на основе типа ткани, происхождения ткани и того, какие методы были признаны наиболее успешными в литературе.
Проблемы диссоциации тканей
Целью большинства процессов диссоциации тканей является получение наиболее жизнеспособных клеток и гарантия того, что метод не окажет отрицательного воздействия на жизнеспособность или функцию клеток. Исследователи должны выбрать правильную комбинацию методов диссоциации, чтобы добиться успеха.Большинство полагается на поиск литературы, но часто сталкивается с противоречивыми советами. Причины противоречивых данных часто можно отнести к различным протоколам и несовместимым и / или нечистым ферментам. Несоответствия могут повлиять на способность исследователей точно интерпретировать данные в рамках их собственных экспериментов и могут сделать невозможным повторение эксперимента для других. Эта вариабельность процесса изоляции также может негативно повлиять на использование этих клеток при трансплантации или клеточной терапии.
Одним из способов решения проблемы вариабельности является создание стандартизированного протокола диссоциации тканей. Если вы посмотрите на ферментативную диссоциацию в качестве примера, могут возникнуть проблемы с определением правильной концентрации фермента, правильного времени инкубации и правильной температуры; неправильное использование этих факторов может привести к повреждению клеток или неполной диссоциации.
Кроме того, еще одним важным ключом к решению проблемы изменчивости является оценка качества ферментов. Ферменты бывают разного качества, включая чистоту, сорт (т.е.е. произведено с использованием надлежащей производственной практики GMP), ферментативной силы и источника (т.е. не животного происхождения). Различия между этими продуктами как по маркам, так и по партиям — проблема для исследователей. Вариабельность часто приводит к непоследовательным или невоспроизводимым результатам.
Руководства по производству продуктов для клеточной терапии все еще развиваются, но в настоящее время применима ссылка на USP 1046, которая указывает на важность квалификации сырья, используемого в производстве.Таким образом, рассмотрение таких вопросов, как происхождение сырья, его целостность, риск загрязнения и то, было ли сырье произведено в соответствии с GMP, важно при планировании производственного процесса, который в конечном итоге будет представлен в государственные органы для утверждения. В результате растет интерес к ферментам, не содержащим животных (AOF), и к ферментам надлежащей производственной практики (GMP).
Необходимость статейных протоколов диссоциации тканей для клинического применения
Чтобы решить проблемы вариабельности, многие исследователи движутся к созданию стандартизированного протокола с использованием сырья GMP и / или AOF для диссоциации тканей, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты исследований и предоставить соответствующие процедуры для трансплантации и клинической клеточной терапии. .Материалы AOF предпочтительны, потому что они не несут риска возможного заражения случайными агентами, такими как вирусы животного происхождения или прионы. Для приложений клеточной терапии эти протоколы включают процесс GMP и ферменты класса GMP, поскольку клеточная терапия, которую считают «более чем минимально управляемой», будет регулироваться FDA как биологический продукт и, следовательно, должна будет соответствовать стандартам GMP. .
Две недавние публикации освещают усилия по созданию согласованных протоколов для приложений трансплантации и клеточной терапии.Я кратко изложил здесь статьи.
Изоляция островка от поджелудочной железы
Потребность в стандартном протоколе GMP была подчеркнута в недавней статье, опубликованной в журнале Transplantation Direct, под названием «Выбор фермента для пищеварения поджелудочной железы человека — критический фактор для повышения успеха изоляции островков». В статье авторы обсуждают свою работу по изоляции островков и важность поиска эффективного и последовательного метода изоляции островков из поджелудочной железы.С этой целью они сравнили ключевые параметры островков для оценки общего качества островков после выделения, сравнивая три фермента: либеразу HI (Roche Diagnostics), коллагеназу NB1 NP (SERVA Electrophoresis GmbH) и либеразу Mammalian Tissue Free (MTF) C / T (Roche Diagnostics). . Для пояснения, эти ферменты предназначены только для дальнейшей обработки, а не для прямого применения у людей.
Островковые клетки для трансплантации
Трансплантация островков — еще один вариант лечения диабета 1 типа.При трансплантации островков островки собирают из поджелудочной железы донора органов, а затем клетки вводят в печень. По данным Национального центра обмена информацией о диабете, «Пациенты с трансплантатом обычно получают две инфузии, в среднем от 400 000 до 500 000 островков на одну инфузию. После имплантации бета-клетки в этих островках начинают вырабатывать и выделять инсулин ».
Авторы исследования объяснили, что изначально для выделения островков использовалась либераза HI, и ее использование привело к увеличению числа пациентов, которым могла быть сделана трансплантация островков.Однако его использование было прекращено в 2007 году из-за опасений по поводу возможного заражения прионами из материалов крупного рогатого скота. Либераза HI не была высокоочищенной и имела серьезные проблемы с изменчивостью от партии к партии, поэтому постоянная изоляция островков и долгосрочное хранение были проблемами. Коллегеназа NB1, дополненная нейральной протеазой (NP), была использована в качестве альтернативы либеразе HI, и это позволило продолжить трансплантацию для производства островков клинической степени.
Исследование
Авторы исследования использовали перфузионный аппарат и ввели один из трех ферментов в исследовании, либеразу HI, коллагеназу NB1 с NP или либеразу MTF C / T.Затем поджелудочную железу разрезали на части и поместили в пищеварительную камеру Рикорди. Переваривание считалось завершенным, когда 50% или более островков были свободны от ткани.
Они обнаружили, что эффективность переваривания была значительно выше, индекс стимуляции глюкозой был выше, а островки имели самый высокий показатель успешности трансплантации у диабетических мышей при использовании либеразы MTF C / T. Кроме того, вариабельность от партии к партии была намного меньше по сравнению с двумя другими ферментами.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины
В другой недавней статье освещена работа по разработке стандартизированного протокола GMP для диссоциации и создания банка мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины. В статье «Новый опубликованный в статьях протокол клинического уровня для хранения клеток ткани пуповины человека», опубликованный в журнале Transfusion, описывается, как авторы создали надежный и эффективный протокол клинического уровня для выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины. с использованием комбинации ферментов и полуавтоматического диссоциатора.
Источник клеток для клеточной терапии
мезенхимальных стволовых клеток изучаются в клинических испытаниях более 10 лет. За это время они прошли испытания на предмет их лечебных свойств против многих заболеваний и травм. Некоторые из этих методов лечения включают повреждение тканей, заболевание сетчатки, БАС (боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз) и печеночную недостаточность.
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) желательны для клеточной терапии, потому что они обладают способностью к самообновлению и многолинейной дифференцировкой в эктодермические и энтодермические клетки мезодермы.Хотя МСК можно найти в большинстве тканей, они изначально были получены из костного мозга. Сейчас их выделяют из многих типов тканей, включая жировую, мышечную, пульпу зуба, плаценту и пуповину. МСК также относительно легко расширить в культуре. В статье подчеркиваются некоторые положительные свойства МСК, выделенных из НКТ, в том числе то, что ткань легко добывается, а клетки демонстрируют более высокую скорость пролиферации. В документе также говорится: «НКТ-МСК обладают многими преимуществами по сравнению с МСК, выделенными из других тканей взрослого человека, благодаря неинвазивной процедуре сбора, их более высокой способности к пролиферации, их низкой имногенности, способности к многолинейной дифференцировке, а также их иммуномодулирующим и трофическим свойствам.”
Из-за привлекательных свойств использования МСК в клеточной терапии существует необходимость изолировать эти клетки таким образом, чтобы это соответствовало требованиям терапевтического применения. Авторы статьи намеревались создать протокол изоляции клинической степени для выделения МСК из НКТ. Желание состояло в том, чтобы создать этот протокол с использованием материала GMP, но также с учетом того, что протоколу все еще необходимо поддерживать методы изоляции и криоконсервации, которые создают наилучшие возможности для хорошего выхода и качества изолированных клеток.
Исследование
В ходе исследования авторы протестировали две стратегии. Первым была ручная диссоциация, а вторым — полуавтоматическая диссоциация с использованием диссоциатора Miltenyi Bio’s GentleMACS. Для начала всю ткань разрезали на мелкие кусочки и поместили в раствор, содержащий PBS, коллагеназу NB6 класса GMP и гиалуронидазу (медицинский продукт). В ручном методе диссоциации ткань и раствор инкубировали в течение 2,5 часов без перемешивания. При полуавтоматической диссоциации образец сначала механически диссоциировали с помощью GentleMACS, а затем инкубировали в течение 1.5 часов в растворе.
Сравнивая два метода, авторы обнаружили, что при использовании комбинации полуавтоматической диссоциации с ферментами на выделение ушло меньше половины времени, чем при использовании только ручной диссоциации, что является важной экономией времени и труда при хранении большого количества клеток. В процессе также были получены клетки, которые имели те же характеристики, что и клетки, выделенные путем ручной диссоциации.
Сводка
Эти две статьи демонстрируют необходимость и успешную реализацию стандартизированного протокола клинического уровня для выделения клеток из образцов тканей.Текущие руководства по производству клеточной терапии указывают на то, что уменьшение вариабельности, необходимость в надлежащей производственной практике и использование материалов неживотного происхождения в отношении диссоциации тканей будет по-прежнему приобретать все большее значение по мере продвижения методов лечения к коммерциализации. Таким образом, важно обмениваться этими протоколами посредством публикации, чтобы другие могли извлечь пользу из этого опыта и чтобы со временем протоколы продолжали становиться более стандартизованными.
Диссоциация ACME: универсальный метод фиксации-диссоциации клеток для транскриптомики отдельных клеток
Диссоциация ACME
Раствор ACME был приготовлен свежим с использованием коммерчески доступной дистиллированной воды без ДНКазы / РНКазы, метанола и др. В соотношении 13: 3: 2: 2. ледяная уксусная кислота и глицерин.Для каждого образца от 10 до 30 взрослых планарий разного размера (культивированных, как описано ранее [13]) добавляли в пробирку Falcon на 15 мл для получения конечного объема биомассы ~ 100-300 мкл. Мы удалили воду с планарий с помощью пипетки Пастера и добавили ~ 100-500 мкл 7,5% N-ацетилцистеина в 1x PBS, что достаточно для покрытия планарий. N-ацетилцистеин помогает очищать слизь планарий и защищает РНК (см. Дополнительное примечание 1). К образцам немедленно добавляли раствор ACME до конечного объема 10 мл на пробирку.В качестве альтернативы на этой стадии к раствору ACME можно добавить N-ацетилцистеин в том же количестве, как указано выше.
Образцы оставляли для диссоциации при комнатной температуре в течение 1 часа на качалке с качелями при 35-45 об / мин, с пробирками, ориентированными параллельно направлению движения. Затем мы несколько раз пипетировали реакции вверх и вниз, чтобы завершить диссоциацию, используя наконечники для пипеток на 1 мл. С этого момента образцы хранили на льду, чтобы предотвратить деградацию РНК. Мы центрифугировали образцы при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C) для удаления раствора ACME.Полученный осадок не является полностью компактным, поэтому надосадочную жидкость необходимо аккуратно выбросить. Для очистки клеток добавляли 7 мл буфера (1x PBS, 1% BSA) и осадок перемешивали встряхиванием. Образцы снова центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C) и супернатант удаляли. Если гранула все еще не была уплотнена, выполнялась дополнительная стадия очистки. Гранулы ресуспендировали в 900 мкл буфера (1x PBS, 1% BSA) и переносили в пробирки Эппендорфа на 1,5 мл.
Для криоконсервации клеток мы добавили 100 мкл ДМСО в пробирку [43] и хранили образцы непосредственно при -80 ° C.Затем мы оттаивали образцы на льду и центрифугировали их при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C) для удаления ДМСО. Супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в 1 мл промывочного буфера (1x PBS, 1% BSA). Образцы снова центрифугировали и осадок снова ресуспендировали в 1 мл свежего промывочного буфера.
Диссоциацию ACME у других животных проводили с модификациями описанного выше протокола. Эмбрионы рыбок данио подвергали дехорионированию перед добавлением раствора ACME и механически разрушали в растворе ACME путем применения коротких импульсов гомогенизации Polytron. Lymnaea stagnalis эмбрионов декапсулировали, пропуская их через шприц, а затем механически разрушали в растворе ACME. Для удаления сломанной яичной скорлупы смеси для диссоциации клеток обоих этих видов пропускали через фильтры CellTrics 100 мкм (Sysmex). Parasteatoda tepidariorum яичные капсулы либо вручную рассекали под микроскопом в растворе ACME, либо механически разрушали в растворе ACME с использованием коротких импульсов гомогенизации Polytron и фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм (Corning). Pristina leidyi взрослых особей встряхивали вручную каждые 10 минут во время диссоциации.
Проточная цитометрия и FACS
Диссоциированные клетки ACME фильтровали через сетчатые фильтры CellTrics 50 мкм (Sysmex), собирали в 1,5 мл пробирки Эппендорфа и окрашивали ядерным красителем DRAQ5 ™ (eBioscience), добавляя 0,5 мкл / мл 5 мМ исходного раствора. и цитоплазматический краситель Конканавалин-А, конъюгированный с AlexaFluor 488 (Invitrogen), добавляя 2 мкл / мл исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл. Концентрации окрашивания требуют оптимизации и в конечном итоге зависят от настроек FACS / цитометра и концентрации клеток.Клетки окрашивали в темноте на льду в течение 30-45 мин и визуализировали с использованием проточного цитометра CytoFlex S (Beckman Coulter) или сортировали с использованием сортировщика клеток BD FACS Aria III (BD Biosciences) Cell Sorter. Чтобы избежать загрязнения РНКазой во время сортировки клеток, FACS тщательно обеззараживали отбеливателем и предварительно охлаждали перед сортировкой, поддерживая в камерах для инъекций и сбора температуру 4 ° C во время процесса. Сортировку выполняли с использованием программного обеспечения BD FACSDiva Software, настроенного в режиме 4-Way Purity, с соплом 85 мкм и разделением при умеренном давлении (45 фунтов на кв. Дюйм).Мы настроили одиночные клетки, положительные по DRAQ5 и по конканавалину-А, которые необходимо отсортировать и собрать вместе в 1,5 мл пробирки Эппендорфа со 100 мкл буфера для сбора (1x PBS, 1% BSA), получив до 500000 клеток на пробирку. Выполнение пробега обычно занимает от 3 до 5 часов.
После сортировки образцы центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C). Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 900 мкл свежего буфера (1x PBS, 1% BSA). На этом этапе мы криоконсервировали клетки, добавив 100 мкл ДМСО и храня их при -80 ° C.
Секвенирование транскриптома на основе лигирования разделенного пула (SPLiT-seq)
Протокол SPLiT-seq выполняли, как описано ранее [34], с модификациями, описанными ниже. Отсортированные образцы размораживали, центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут (4 ° C), супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 100-200 мкл буфера (1x PBS, 1% BSA) и объединяли вместе. Мы окрашивали 100 мкл этих клеток в разведении 1:10 в течение 15-20 минут и подсчитывали эту подвыборку с помощью проточной цитометрии. Оставшуюся часть объединенных клеток затем разводили до конечной концентрации 1.25 M клеток / мл (10000 клеток на лунку для раунда обратной транскрипции).
Подготовка планшетов
Штрих-коды были предоставлены лиофилизованными с помощью интегрированных ДНК-технологий на трех 96-луночных исходных планшетах: Stock-1 (хорошо специфичные закрепленные поли (dT) штрих-коды 1 раунда), Stock-2 (специфичные для лунок штрих-коды 2 раунда). ) и Stock-3 (хорошо специфичные штрих-коды 3-го раунда). Лиофилизированные штрих-коды ресуспендировали в воде, свободной от ДНКазы / РНКазы, до конечной концентрации 100 мкМ / лунку. Из исходных планшетов мы приготовили еще три планшета при определенных рабочих разведениях (планшеты WD).Используя многоканальную пипетку, мы приготовили WD-1 с 12 мкл соответствующего штрих-кода из Stock-1 и 88 мкл воды, свободной от ДНКазы / РНКазы, на лунку. Для WD-2 мы смешали 12 мкл соответствующего штрих-кода из Stock-2, 11 мкл Linker_1 (100 мкМ) и 77 мкл воды, свободной от ДНКазы / РНКазы, на лунку. Наконец, WD-3 был приготовлен из 14 мкл соответствующего штрих-кода из Stock-3, 13 мкл Linker_2 (100 мкМ) и 73 мкл воды, свободной от ДНКазы / РНКазы, на лунку.
При общем объеме 100 мкл на лунку, планшета WD-1 хватит на 25 экспериментов (4 мкл на эксперимент), а планшетов WD-2 и WD-3 хватит на 10 экспериментов (10 мкл на эксперимент).Перед тем, как следовать протоколу SPLiT-seq, планшеты WD-2 и WD-3 нагревали до 95 ° C в течение 2 минут и снижали до 20 ° C со скоростью -0,1 ° C / с, чтобы отжечь 5 ‘конец каждого олигонуклеотида штрих-кода к универсальному олигонуклеотидному линкеру.
Первый раунд штрих-кодирования: обратная транскрипция
Первый раунд штрих-кодирования проводили с помощью внутриклеточной обратной транскрипции (ОТ). Исходный протокол SPLiT-seq использует комбинацию случайного гексамера и закрепленных поли (dT) олигонуклеотидов [34]. Мы использовали только последнее.96-луночный планшет, свободный от нуклеаз (Round-1), готовили на льду путем переноса 4 мкл / лунку из эквивалентных положений в WD-1. Затем мы добавили 8 мкл / лунку RT-смеси в планшет: 4 мкл 5-кратного RT-буфера (Thermo Scientific), 0,35 мкл ингибитора РНКазы SUPERase-In (20 Ед / мкл, Invitrogen), 1 мкл 10 мМ / каждый dNTP. (New England BioLab), 1,65 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 1 мкл Maxima H Minus RT (Thermo Scientific). Наконец, в каждую лунку также добавляли 8 мкл предварительно подсчитанных клеток (1,25 M клеток / мл), что дало общий объем 20 мкл / лунку.Планшет Round-1 инкубировали в термоциклере в течение 30 мин при 50 ° C и сразу же помещали на лед. Затем отдельные реакции объединяли вместе в пробирке Falcon на 15 мл на льду, и планшет Round-1 отбрасывали. Мы добавили 9,6 мкл 10% Triton X-100 к объединенным клеткам (конечная концентрация 0,1%) и центрифугировали их при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C). Мы сливали супернатант и ресуспендировали осадок в 2 мл 1x буфера NEB 3.1 (New England Biolabs).
Раунд 2 штрих-кодирования: лигирование 1
Второй этап штрих-кодирования проводили путем реакции лигирования.Новый 96-луночный планшет (Round-2) был приготовлен на льду с 10 мкл / лунка штрих-кодов из эквивалентных положений в ранее отожженном планшете WD-2. Затем к 2 мл клеток добавляли 2 мл смеси для лигирования (500 мкл буфера для лигазы Т4 10x (NEB), 100 мкл ДНК-лигазы Т4 (400 ед / мкл, NEB) и 1500 мкл воды, свободной от нуклеаз). в 1x NEB buffer 3.1 и тщательно перемешать в одноразовой тазике. Мы добавили 40 мкл / лунку этой смеси для лигирования (включая клетки) в планшет Round-2 и накрыли его липкой пломбой для планшета для ПЦР.Планшет инкубировали в термоциклере 30 мин при 37 ° C. Чтобы заблокировать Linker_1 после инкубации, был приготовлен блокирующий раствор с 264 мкл Blocker_1 (конечная концентрация 26,4 мкМ), 250 мкл T4-лигазного буфера 10x (NEB) и 486 мкл воды, свободной от нуклеаз. После инкубации крышку планшета Round-2 удаляли и в каждую лунку добавляли 10 мкл блокирующего раствора, получая конечный объем 60 мкл / лунку. Планшет снова закрывали новой липкой крышкой и инкубировали еще 30 мин при 37 ° C для связывания олигонуклеотидов Linker_1 и Blocker_1.
Раунд 3 штрих-кодирования: лигирование 2
Третий цикл штрих-кодирования выполняли посредством второй реакции лигирования. Чтобы подготовить планшет Round-3, мы заполнили 96-луночный планшет 10 мкл / лунку штрих-кодов из эквивалентных позиций в предварительно отожженном планшете WD-3. После извлечения планшета Round-2 из инкубатора крышку снимали, а клетки собирали вместе в новый одноразовый резервуар. Мы добавили 100 мкл ДНК-лигазы Т4 (400 Ед / мкл, NEB) в таз и тщательно перемешали с клетками.Затем планшет Round-3 наполняли 50 мкл / лунку этого раствора клеточной лигазы, герметизировали клейкой пленкой для ПЦР-планшета и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C. Раствор для терминации был приготовлен с 288 мкл Blocker_2 (конечная концентрация 11,5 мкМ), 625 мкл EDTA (для остановки активности лигазы) и 1587 мкл воды, свободной от нуклеаз. Мы добавляли 20 мкл / лунку раствора для терминации в планшет Round-3 (для конечного объема 70 мкл / лунку) без дальнейшей инкубации. После этого клетки объединяли в пробирку Falcon на 15 мл и помещали на лед.
Лизис клеток
После добавления 70 мкл 10% Triton-X 100 (конечная концентрация 0,1%) объединенные клетки центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C). Мы осторожно удалили супернатант (оставив около 100 мкл) и ресуспендировали клетки в 4,04 мл промывочного буфера (4 мл 1x PBS и 40 мкл 10% Triton X-100, предварительно смешанные, чтобы позволить пузырькам Triton осесть). Клетки снова центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин (4 ° C).
После удаления супернатанта мы ресуспендировали клетки в 50 мкл 1x буфера PBS.Мы разводили 5 мкл этой ресуспензии в 195 мкл 1x PBS и подсчитывали количество клеток с помощью проточной цитометрии, чтобы определить количество подбиблиотек. Затем мы разделили аликвоты оставшихся 45 мкл клеток в пробирки Эппендорфа на 1,5 мл в соответствии с концентрацией клеток, полученной с помощью проточной цитометрии. Для эксперимента, описанного здесь, мы создали три различных подбиблиотеки ~ 15 000 клеток / каждая. Объем каждой подбиблиотеки доводили до 50 мкл с помощью 1x PBS.
Буфер для лизиса был приготовлен с Трис pH 8.0 (20 мМ), NaCl (400 мМ), EDTA pH 8,0 (100 мМ) и SDS (4,4%). Мы добавили 50 мкл буфера для лизиса и 10 мкл протеиназы K (20 мг / мл) в каждую подбиблиотеку и инкубировали лизаты при 55 ° C в течение 2 часов, вручную встряхивая пробирку каждые 15 минут. После инкубации лизаты замораживали при -80 ° C.
Очистка кДНК с помощью магнитных шариков
Мы использовали 44 мкл стрептавидина C1 Dynabeads ™ MyOne ™ (Invitrogen) на лизат для очистки кДНК путем связывания шариков с молекулой биотина на 3 ’конце третьего штрих-кода.Мы следовали протоколу производителя для очистки нуклеиновых кислот Dynabead с модификациями, взятыми из протокола Розенберга и др.: Промывочный буфер производителя (1x B&W) был приготовлен с добавлением 0,05% конечной концентрации Твина-20. Лизаты инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с 5 мкл 100 мкМ PMSF (разведенного в изопропаноле) для ингибирования активности протеиназы К. Лизаты инкубировали с магнитными шариками в течение 60 мин при комнатной температуре при вращении. Во время промывки образцы перемешивали в буфере 1x B & W / Tween-20 в течение 5 минут при комнатной температуре.Наконец, шарики ресуспендировали в 250 мкл 10 мМ буфера Tris-T (10 мМ Tris-HCl pH, 0,1% Tween-20 и 0,2% ингибитор РНКазы SUPERase-In) и хранили при 4 ° C.
Template Switch
Смесь переключателя шаблона была приготовлена из 44 мкл 5x RT буфера (Thermo Scientific), 44 мкл 20% Ficoll PM 400 (Sigma Aldrich), 22 мкл 10 мМ / каждый из четырех dNTP (NEB) , 5,5 мкл праймера TSO (100 мкМ), 11 мкл Maxima H Minus RT и 93,5 мкл воды, свободной от нуклеаз, на образец. Гранулы, связанные с кДНК, промывали с помощью магнитной стойки 250 мкл воды, свободной от нуклеаз (без ресуспендирования), и ресуспендировали в 200 мкл смеси переключателя матрицы.Образцы инкубировали в смеси 30 мин при комнатной температуре, а затем 90 мин при 42 ° C при перемешивании. После инкубации смесь переключателя шаблона удаляли с помощью магнитной стойки; шарики ресуспендировали в 250 мкл буфера Tris-T и хранили при 4 ° C. На этом этапе шарики можно хранить в холодильнике (4 ° C) до 4 дней и повторно использовать хотя бы один раз для последующих этапов.
ПЦР-амплификация
Смесь для ПЦР была приготовлена с использованием 110 мкл 2x Kapa HiFi HotStart ReadyMix (Roche), 8.8 мкл PCR_PF (10 мкМ), 8,8 мкл PCR_PR (10 мкМ) и 92,4 мкл воды, свободной от нуклеаз. Образцы из реакции переключения шаблона помещали в магнитный штатив и промывали 250 мкл воды (без ресуспендирования). После удаления промывочной жидкости их затем ресуспендировали в 220 мкл смеси для ПЦР и каждую разделяли на 4 пробирки для ПЦР. В термоциклере выполнялась следующая программа: 95 ° C (3 мин) и пять циклов при 98 ° C (20 с), 65 ° C (45 с) и 72 ° C (3 мин). Затем 4 реакции для каждой библиотеки были объединены в одну 1.Пробирки Эппендорфа по 5 мл на библиотеку и Dynabeads разделяли с помощью магнитной стойки. 200 мкл супернатанта, содержащего кДНК в суспензии, снова разделяли на 4 пробирки для ПЦР и переносили в планшет для кПЦР (50 мкл / лунку).
Мы добавили 2,5 мкл 20x EvaGreen (Biotium) в каждую лунку и запустили следующую программу в термоциклере для количественной ПЦР: 95 ° C (3 мин), цикл до фазы плато, обычно 8-10 циклов, при 98 ° C (20 с), 65 ° C (20 с) и 72 ° C (3 мин), и окончательное удлинение при 72 ° C (5 мин).
Выбор размера
Мы очистили реакции КПЦР путем выбора размера SPRI для удаления фрагментов меньше 300 п.н.Мы использовали Kapa Pure Beads (Roche) в соотношении 0,8x и следовали протоколу производителя «Очистка фрагментированной ДНК в рабочих процессах NGS» с двумя модификациями, взятыми из исходного протокола SPLiT-seq: этапы промывки выполнялись с 750 мкл 85% этанол и кДНК элюировали в 20 мкл воды, свободной от нуклеаз, при 37 ° C в течение 10 мин.
Мечение
Подбиблиотеки были помечены с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК Nextera (Illumina). После выбора размера SPRI 0,8x, описанного выше, мы количественно оценили суббиблиотеки с помощью Qubit (Thermo Fisher) и разводили 50 нг кДНК в общем объеме 20 мкл воды, свободной от нуклеаз.Реакционную смесь для мечения готовили с 20 мкл кДНК (50 нг), 25 мкл буфера для тегирования и 5 мкл фермента 1 и инкубировали в предварительно нагретом термоциклере в течение 5 мин при 55 ° C, сразу же помещали на лед при температуре окружающей среды. конец этого временного периода. Мы нейтрализовали активность фермента 1 по мечению, немедленно очистив реакцию с помощью набора Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (NEB) в соответствии с протоколом производителя. Образцы элюировали в конечном объеме 20 мкл воды UltraPure.
Раунд 4 штрих-кодирования: PCR
Четвертый штрих-код был введен с помощью PCR.Мы подготовили отдельную реакционную смесь для каждой библиотеки, содержащую 20 мкл меченой кДНК, 25 мкл 2x Kapa HiFi HotStart ReadyMix (Roche), 1,5 мкл P5_oligo (10 мкМ) и 1,5 мкл штрих-кода 4 раунда (10 мкМ). Для трех подбиблиотек, используемых в настоящем исследовании, мы использовали олиго Round4_1, Round4_2 и Round4_3. Параллельно с реакцией ПЦР мы провели количественную ПЦР, добавив 2,5 мкл 20x EvaGreen (Biotium) к одной реплике образца для визуализации фазы плато. Программа ПЦР выполнялась следующим образом: 95 ° C (30 с), цикл до фазы плато (8-10 циклов) при 95 ° C (10 с), 55 ° C (30 с) и 72 ° C (30 с), и окончательное удлинение при 72 ° C (5 мин).Реакции ПЦР выбирали по размеру (SPRI 0,7x) путем смешивания 40 мкл образца с 28 мкл Kappa Pure Beads (Roche) и следуя протоколу выбора размера, описанному выше. Каждую суббиблиотеку ресуспендировали до конечного объема 20 мкл в воде, свободной от нуклеаз, и распределение фрагментов проверяли с помощью биоанализатора (Agilent High Sensitivity DNA Kit) в соответствии с протоколом производителя.
Секвенирование и контроль качества
Три подбиблиотеки были объединены и секвенированы на платформе NovaSeq 6000 (Illumina) компанией Novogen с длиной 150 п.н., парные считывания с конца.Эти показания были предоставлены без какой-либо проверки качества, за исключением базовой проверки целомудрия. Поэтому они подвергались первоначальной проверке качества с помощью FastQC. Качество чтения Phred в целом было хорошим, но адаптер и содержимое N требовали обработки и удаления. CutAdapt v2.8 [53] использовался для обрезки остаточной последовательности адаптера, низкого качества и коротких чтений. Различные стратегии очистки использовались для чтения 1 (последовательность транскрипта) и чтения 2 (последовательности UMI и штрих-кода). Для чтения 1 запускали cutadapt -j 4 -m 60 -q 10 -b AGATCGGAAGAG, удаляя остаточный универсальный адаптер Illumina и длину считывания короче 60 п.н.Для чтения 2 был запущен cutadapt -j 4 -m 94 —trim-n -q 10 -b CTGTCTCTTATA, удалив чтения короче 94 п.н. (минимум для охвата всех штрих-кодов), терминальные N и остаточную последовательность адаптера Nextera. Последовательности чтения 2 были проверены на «фазу» (то есть были ли штрих-коды в правильном положении из-за возможных отступов) с использованием grep для сравнения, полученная от адаптера фланкирующая последовательность была правильно позиционирована с последовательностью каждого считывания. Показания сохранялись консервативно, и только считывания со штрих-кодами UMI и UBC в правильном месте переносились для дальнейшего анализа.Дефазирование, хотя и рекомендуется, не оказалось серьезной проблемой, и очень немногие чтения были отброшены. Makepairs (https://github.com/sestaton/Pairfq/wiki/makepairs) использовался для сохранения только парных чтений, а следующий раунд анализа FastQC был использован для подтверждения удаления всех обнаруживаемых адаптеров и последовательности низкого качества.
Картирование считывания, извлечение штрих-кода и производство матрицы
Геном S. mediterranea S2F2 [47] был загружен с Planmine, а геном D. japonica v 1.0 [48] был загружен с http://www.planarian.jp. Модели гена De novo были созданы как для S. mediterranea , так и для D. japonica . 183 опубликовали S. mediterranea и 43 D. japonica Наборы данных RNAseq были загружены из NCBI SRA и Банка данных ДНК Японии, включая все те, которые были перечислены на момент анализа. Эти собранные считывания были сопоставлены с соответствующими эталонными геномами с помощью HiSat 2.1.0 [54]. Затем StringTie и StringTie — merge [55] были использованы для объединения результатов картирования с существующими моделями генов высокой достоверности SMESG от Planmine ( S.mediterranea ) и полные модели генов, полученных из v1 AUGUSTUS, с http://www.planarian.jp ( D. japonica ). Изоформные варианты, длина которых превышала 100 т.п.н., были удалены из набора генов как вероятные артефакты (588 в D. japonica , 617 в S. mediterranea). Файлы D. japonica и S. mediterranea fasta и gtf были затем объединены для создания объединенной базы данных для картирования. Затем Drop-seq_tools-2.3.0 (https://github.com/broadinstitute/Drop-seq) использовался для создания словаря последовательностей, refFlat, сокращенных файлов GTF и интервалов.Индекс STAR-2.7.3a [56] был сгенерирован с использованием параметров —sjdbOverhang 99 —genomeSAindexNbases 13 —genomeChrBinNbits 14 для обоих геномов, объединенных вместе (для измерения коллизий, см. Ниже).
Затем каждая из трех подбиблиотек, секвенированных в настоящей рукописи, обрабатывалась отдельно. Набор инструментов SPLiTseq (https://github.com/RebekkaWegmann/splitseq_toolbox), который включает многие компоненты Drop-seq_tools-2.3.0 (https://github.com/broadinstitute/Drop-seq), использовался для извлечения, проверить и исправить штрих-коды (корректировка с расстоянием Хэмминга ≤ 1).Сопоставление было выполнено с использованием STAR-2.7.3a [56], с —quantMode GeneCounts и всеми другими настройками по умолчанию. Picard v2.21.1-SNAPSHOT (Broad Institute, http://broadinstitute.github.io/picard/) SortSam и MergeBamAlignment использовались для изменения порядка и объединения выровненных и помеченных чтений. Drop-seq_tools-2.3.0 TagReadWithInterval и TagReadWithGeneFunction были затем последовательно запущены, чтобы отметить местоположение сопоставления, с использованием пользовательских файлов refFlat и genes.intervals, созданных выше. Затем к клеточному штрих-коду каждой подбиблиотеки был добавлен дополнительный символ (A, T или C), чтобы можно было различать идентичные клеточные штрих-коды из разных подбиблиотек.Затем было разделено картирование считываний на D. japonica и S. mediterranea . Эти файлы сопоставления затем использовались для создания матриц выражений с помощью Drop-seq_tools-2.3.0 DigitalExpression для каждой библиотеки индивидуально со следующими настройками: READ_MQ = 0, EDIT_DISTANCE = 1, MIN_NUM_GENES_PER_CELL = 100, LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC. Эти матрицы вместе с новыми моделями генов и необработанными считываниями были загружены в NCBI GEO, номер доступа GSE150259.
Идентификация признаков и кластеризация Seurat
Матрицы цифровых выражений для каждой подбиблиотеки были загружены в Seurat v 3.1.0 [57] в R v 3.6.2 и объект Seurat, созданный для каждого, с min.cells = 1 и min.features = 125 (хотя обратите внимание на ограничение создания матрицы, описанное выше). Ячейки с количеством UMI больше 5000 были исключены с subset = nCount_RNA <5000. Данные были нормализованы, и были выбраны переменные функции (selection.method = «vst», nfeatures = 10000) и данные были масштабированы. Затем три библиотеки были объединены (слияние (x = L1, y = list (L2, L3), add.cell.ids = add.cell.ids, merge.data = FALSE)). Данные снова нормализовали (нормализация.method = «LogNormalize», scale.factor = 10000) и выбранных переменных (split.by = «library», nfeatures = 10000, verbose = TRUE, fvf.nfeatures = 10000, selection.method = «vst»). Анализ главных компонентов (PCA) был проведен для 50 основных компонентов. JackStrawPlots и ElbowPlots были созданы для понимания размерности данных (графики не показаны). Кластеризация проводилась с разрешением = 1 ( D. japonica) или 1,4 ( S. mediterranea) и исходным алгоритмом Лувена.Представления UMAP были созданы со следующими настройками: dims = 1:50, reduce = «pca», spread = 1, metric = «euclidean», seed.use = 1 и n.neighbors = 45, min.dist = 0.4 ( D. japonica) и n.neighbours = 35, min.dist = 0,5 ( S. mediterranea) . Прогнозы UMAP отображались как по кластерам, так и по библиотекам для анализа пакетных эффектов. Дальнейшая коррекция эффекта партии не потребовалась. Ряд разрешений был опробован и вручную сравнен со списками маркеров для определения наиболее подходящего отсечения для отображения.Кластеры были перекрашены изначально в Сёра по мере создания графиков. Маркеры были извлечены из Сера с помощью функции FindAllMarkers. Количество ячеек в кластере было извлечено с помощью функции Idents. FeaturePlot использовался для выделения экспрессии отдельных маркеров в ячейках в нашем наборе данных, чтобы помочь с идентификацией кластера ячеек. VlnPlot использовался для создания скрипичных графиков содержания генов и UMI в каждой библиотеке с использованием логарифмической шкалы.
Назначение идентификатора кластера
Для установления идентификатора S.mediterranea , мы сопоставили обнаруженные в них маркеры с маркерами из нашей предыдущей публикации [13]. Типичные примеры показаны на дополнительном рисунке S2. Новые кластеры клеток нейроны глаза-53, серотониновые нейроны, клетки канальцев протонефридий и клетки пламени протонефридий были названы соответственно по экспрессии маркеров eye-53-1 (SmMSTRG.4014, dd_Smed_v6_889_0_1) [58], sert (SmMSTRG. 6717, dd_Smed_v6_12700_0_1) [59, 60], CAVII-подобный (SmMSTRG.5392, dd_Smed_v6_4841_0_1) [61] и egfr-5 (SmMSTRG.13890, dd_Smed_v6_11310_0_1) [62]. Чтобы установить идентичность кластеров клеток D. japonica , мы обнаружили известные гомологов S. mediterranea верхних кластерных маркеров D. japonica , как указано ниже, и исследовали их экспрессию в наших S. mediterranea и Характеристики D. japonica .
Чтобы установить гомологию маркеров между нашими новыми моделями генов и последовательностями известных генов из предыдущих публикаций, мы использовали разные подходы для каждого вида.Для S. mediterranea сравнения с ранее каталогизированными генами: blastn megablast [63] известных нуклеотидных последовательностей для наших генных моделей (отсечка значений E = E <10 −99 , хотя обычно наилучшее совпадение = 0) и Автономный BLAT v. 36 × 5 (-out = blast8) [64] был использован для поиска четко гомологичных последовательностей. Для D. japonica использовался тот же подход для поиска гомологов между нашими новыми моделями генов и известными генами D. japonica , когда это было необходимо.Однако для аннотирования на основе известных последовательностей S. mediterranea были использованы белковые последовательности ранее идентифицированных генов S. mediterranea для поиска нашего нового набора генов D. japonica с использованием tblastn (значение E отсечка = E <10 -99 ), наряду с поиском нуклеотидов против нуклеотидов blat, как описано ранее. Секреторные кластеры были условно названы 1-7 и a-h в соответствии с их численностью, так как точное соответствие их с ранее опубликованными экспериментами и гомология между видами планарий требует дальнейших исследований.
Другие анализы, выполненные для данных RNAseq одиночных клеток
Чтобы проверить, было ли наше библиотечное секвенирование насыщенным при заданной глубине чтения, чтения были случайным образом уменьшены с использованием seqtk (10%, 25%, 50% и 75% от общей глубины чтения). Эти результаты считывания были извлечены из наших окончательных файлов BAM и использованы для генерации номеров UMI и генов на ячейку для набора штрих-кодов ячеек, идентифицированного из наших полных результатов (NB: поскольку файлы BAM были упорядочены в процессе генерации данных, выборка из файла BAM напрямую, скорее всего, вернет неслучайные результаты).Используя матрицы, полученные из полных данных для S. mediterranea и D. japonica , был построен график «скотного двора» для двух видов, показывающий UMI на штрих-код клетки для каждого из видов. Столкновения были определены как штрих-коды клеток, разделяющие более 10% своих UMI с представителями меньшинств на этом графике. Функция Seurat FeaturePlot использовалась для окрашивания клеток на наших графиках, экспрессирующих определенные генные маркеры.
Оптимизация диссоциации ксенотрансплантата опухоли для профилирования маркеров клеточной поверхности и транспортеров питательных веществ
Ксенотрансплантаты опухоли человека у мышей
Образцы рака груди человека были получены после информированного согласия пациентов, перенесших операцию.Свежие фрагменты опухоли прививали в межлопаточную жировую подушку 8-12-недельных самок мышей Swiss nude (Harlan Laboratories, L’Arbresle, Франция) под анестезией авертином. Мышей содержали в помещениях для животных, свободных от патогенов (Институт Кюри, Париж, Франция), и им вводили эстроген (17 мг / мл), разведенный в питьевой воде. Ксенотрансплантаты появились на участке трансплантата через 2–8 месяцев после первичной трансплантации. Впоследствии они были трансплантированы вторичным реципиентам и считались установленными после третьего пассажа in vivo . 22 Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями UKCCCR по этике животных. 23 В данном исследовании использовались хорошо зарекомендовавшие себя модели опухолей с минимальным размером опухоли 600 мм 3 . Основные характеристики ксенотрансплантатов, использованных в этом исследовании, представлены в дополнительной таблице 1.
Диссоциация тканей
Для максимального увеличения выхода и жизнеспособности клеток используются различные комбинации ферментов, включая коллагеназу III (200 Ед / мл; Sigma-Aldrich, St Louis, MO , США), ДНКазу I (200 Ед / мл; Sigma-Aldrich) и трипсин (5 мг / мл; Invitrogen, Мэдисон, Висконсин, США) и NEDB (Invitrogen).
Вкратце, мышей умерщвляли, опухоли удаляли в холодную культуральную среду и немедленно обрабатывали. Окружающие ткань груди мыши и жир были удалены. Опухоли измельчали на фрагменты размером 2–4 мм, которые затем инкубировали с соответствующими растворами для диссоциации, NEDB или ферментами, в течение 30 мин при 37 ° C. Фрагменты опухоли перемешивали вверх и вниз каждые 10 мин, используя микропипетку объемом 1000 мкм, л с кончиком, обрезанным до диаметра, адаптированного к размеру фрагмента ткани. После каждого периода инкубации фрагменты фильтровали через сетчатый фильтр для клеток с нейлоновой сеткой 40 мкм мкм (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США).Освободившиеся клетки центрифугировали при 1200 об / мин. в течение 2 мин и хранили в холодной CO 2 -независимой среде с 30% FCS при 4 ° C. К оставшимся фрагментам ткани добавляли свежий диссоциативный раствор на 30 мин. Диссоциация прекращалась, когда не высвобождались дополнительные клетки. Фрагменты пропускали через сито, и все клетки за все периоды инкубации объединяли и подсчитывали.
Протестированные протоколы диссоциации суммированы на рисунке 1: Протокол E (ферменты) состоял из трех последовательных инкубаций с коллагеназой III и ДНКазой I.Протокол Try + E (трипсин плюс ферменты) состоял из трех последовательных инкубаций с коллагеназой III и ДНКазой I, дополненной трипсином. Протокол NEDB + E (NEDB плюс ферменты) состоял из двух последовательных инкубаций с NEDB, за которыми следовало одно ферментативное расщепление с коллагеназой III и ДНКазой I. Протокол NEDB + E + TRY (NEDB плюс ферменты плюс трипсин) был таким же, как протокол NEDB + E с трипсином, добавленным к коктейлю коллагеназа III / ДНКаза I.
Рисунок 1Урожайность и жизнеспособность опухолевых клеток после различных протоколов диссоциации и очистки тканей.( a ) Извлечение жизнеспособных клеток определяли на репрезентативном ксенотрансплантате указанных моделей рака молочной железы. Жизнеспособность оценивали по исключению трипанового синего после буферов на основе трипсина (TRY) и других ферментов (E) или неферментативной диссоциации (NEDB), по отдельности или в различных комбинациях. Результаты выражаются в количестве жизнеспособных клеток на грамм опухоли (% жизнеспособных клеток). Значительные различия наблюдались между комбинациями диссоциации, измеренными как по жизнеспособности, так и по количеству клеток (двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с пост-тестом Бонферрони, * P <0.05, ** P <0,01 и *** P <0,001). ( b ) После выбора обработки ферментами NEDB + оценивали эффекты различных препаратов фиколла. Условия двойной плотности (DD) и обычно используемые условия низкой плотности (LD) для фиколла показали статистические различия в количестве клеток (двухфакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Бонферрони, * P <0,05, NS, недостоверно). HD, высокая плотность.
Диссоциированные клетки наслаивали на двойной градиент фиколла (Histopaque; Sigma-Aldrich; плотности 1.077 и 1.119), как описано для отделения лейкоцитов, и центрифугировали при 700 г в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки, удаленные с обоих интерфейсов, объединяли и дважды промывали в среде, не зависящей от CO 2 , и хранили при 4 ° C. Хранение в течение ночи существенно не повлияло на жизнеспособность клеток.
Жизнеспособность клеток и культура
Количество и жизнеспособность клеток оценивали сразу после диссоциации путем исключения трипанового синего на гемоцитометре. Для анализа жизнеспособности культуры ex vivo 40 000 клеток помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном в 100 мкл мкл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с 10% FCS и глутамином, пируватом натрия, пенициллином и стрептомицином при 37 ° C.Жизнеспособность культивируемых диссоциированных клеток с течением времени оценивали с помощью WST-1, анализа, основанного на расщеплении соли тетразолия респираторными митохондриальными ферментами (Roche, Индианаполис, Индиана, США). Отмеренное количество 10 мкл мкл WST-1 добавляли в шесть повторяющихся лунок в разные моменты времени. Среднюю оптическую плотность при 450 нм наносили на график в зависимости от времени. В конечный момент времени клетки трипсинизировали и окрашивали на мыши по сравнению с человеческими маркерами , чтобы определить, произошли ли жизнеспособные клетки из опухоли человека или стромы мыши.
Культивированные диссоциированные клетки обрабатывали ex vivo противораковыми препаратами. Диссоциированные клетки (40 000 на лунку) помещали аликвотами в 96-луночные планшеты с плоским дном. Через 3 дня среду меняли и добавляли доцетаксел (Aventis Pharma, Antony, Франция) или цисплатин (Merck, Дармштадт, Германия) в указанных концентрациях. После 72 ч инкубации в присутствии или в отсутствие любого соединения жизнеспособность оценивали с помощью WST-1, и 50% ингибирующую концентрацию (IC 50 ) рассчитывали по соответствующей сигмоидной аналитической кривой.
Создание и продуцирование RBD
h3RBD.mFc, KoRBD.mFc, RD114RBD.mFc и ARBD.rFc иммуноадгезины были получены из последовательностей, кодирующих первые 178, 253, 222 и 244 аминокислоты вируса Т-клеточного лейкоза человека ( HTLV) -2, эндогенный ретровирус коалы (KoRV), RD114 и Amphotropic-MLV Env соответственно. Соответствующую последовательность, кодирующую RBD, сливали с Fc-фрагментами IgG мыши (mFc) или кролика (rFc). Все конструкции были вставлены в эукариотический вектор экспрессии pCSI 24 и трансфицированы в клетки 293Т методом кальций-фосфатного осаждения.Клетки промывали через 16 часов и инкубировали еще 48 часов в бессывороточной среде Optipro SFM (Invitrogen) с добавлением глутамина и заменимых аминокислот. Кондиционированные среды собирали, фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и мкм концентрировали в 100 раз центрифугированием при 3600 об / мин. на концентраторах Icon с отсечкой 9 кДа (Thermoscientific Pierce, Rockford, IL, USA). Образцы разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C. Каждый препарат проверяли на целостность с помощью вестерн-блоттинга, и концентрации иммуноадгезина измеряли с помощью ELISA с использованием Fc против кроличьих или антимышиных IgG.
Анализ клеток с помощью проточной цитометрии
Клетки окрашивали следующим образом: 3-5 × 10 5 жизнеспособных клеток окрашивали в PBS / 2% FCS с крысиным анти-мышиным Pan H-2 (CMH-I) mAb, связанным к PE (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США), мышиным mAb против EpCAM (CD326), связанным с PerCpCy5.5 (BioLegend), и мышиным mAb против CD44 человека APC-H7 (BD Biosciences) в течение 20 мин при 4 ° C в темноте. Клетки промывали два раза PBS / 2% BSA и добавляли 2 нг / мл 4 ‘, 6’-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Invitrogen).В некоторых случаях клетки после окрашивания фиксировали в 0,05% параформальдегиде.
Для обнаружения апоптозных клеток 3–5 × 10 5 жизнеспособных клеток окрашивали в растворе 1 × FLICA (флуоресцентный лиганд, ингибитор активируемой каспазой) с использованием FAM-DEVD-FMK, специфического лиганда активной каспазы-3 и -7 (AbD Serotec, Роли, Северная Каролина, США) в соответствии с рекомендациями производителя. После инкубации в течение 1 ч при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 клетки промывали два раза PBS / 2% BSA и добавляли 2 нг / мл DAPI (Invitrogen).
Для индукции апоптоза HBCx-14 был диссоциирован в соответствии с протоколом, описанным выше, высеян в 6-луночные пластиковые чашки из расчета 1 × 10 6 клеток на лунку в 2 мл культуральной среды с добавлением 10% FCS и адаптированной к ex vivo в течение 72 часов. СРТ11 (камптотецин) добавляли при обновлении среды в разное время и в разных концентрациях. Через 48 ч каждую лунку собирали с использованием трипсина. Суспензии единичных клеток окрашивали FLICA в соответствии с инструкциями производителя.
Для мечения переносчика метаболитов 3–5 × 10 5 жизнеспособных клеток инкубировали в премиксе RBD, состоящем из 3 мкл мкл RBD, слитого с Fc мыши или кролика, в общей сложности 50 мкл мкл среды в течение 30 мин при 37 ° C. Клетки промывали один раз, а затем инкубировали либо со вторичным козьим антителом против мыши, связанным с AF488 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), либо с козьим антителом против кролика, связанным с AF647 (технология Cell Signaling), в течение 30 минут при 4. ° C.Клетки промывали один раз PBS / 5% BSA, а затем окрашивали сопряженными с PE крысиными антителами к Pan H-2 PE (BioLegend) и мышиными антителами против EpCAM человека (CD326) (BioLegend), связанными с PerCpCy5.5. Клетки промывали два раза PBS / 5% BSA и добавляли 2 нг / мл DAPI перед анализом проточной цитометрии.
Сбор и обработка данных проточной цитометрииКлетки
анализировали на стандартном LSRII (BD Biosciences) с возбуждением 488, 633 и 407 нм. Контроли «флуоресценция минус один» (FMO) использовали для установления отрицательных пороговых значений. 25 Результаты были рассчитаны с точки зрения молекул эквивалентных значений растворимого флуорохрома (MESF) по сравнению с шаблоном микросфер (квантовые шарики MESF AF647 и AF488; Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA).
Фоновые уровниRBD определяли на основе флуоресценции, обнаруженной после окрашивания только вторичным конъюгированным антителом.
Анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star, Ashland, OR, США).
Статистический анализ
Непараметрический односторонний дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса использовался для межгрупповых сравнений для каждого уровня экспрессии переносчика.Непараметрический порядок ранжирования Спирмена измерял корреляцию между двумя различными методами, используемыми для количественного определения CD44 и CD24. Непараметрический непарный тест Манна – Уитни t подчеркивает разницу в уровне экспрессии CD44, измеренную с помощью цитометрии и , оцениваемую считывающим устройством IHC. Метод Тьюки использовался в качестве индикатора дисперсии выхода живых клеток из диссоциированных опухолей, выявляя выбросы набора данных за пределами 1,5-кратного межквартильного диапазона.
Иммуногистохимия
Образцы фиксировали в формалине (10% (об. / Об.) В PBS), обезвоживали и заливали парафином.Срезы (4 мкм, мкм) окрашивали гематоксилином-эозином-сафранином в соответствии со стандартными гистологическими процедурами в мультистрейнере Leica ST 5020.
Для окрашивания CD44 к предметным стеклам Superfrost Plus (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США) приклеивали 4- мкм срезы размером мкм, сушили в течение ночи при 40 ° C и нагревали до 60 ° C в течение 1 часа. Срезы депарафинизировали в течение ночи, регидратировали и демаскировали в цитратном буфере (10 мМ), pH 6, в течение 20 минут в микроволновой печи мощностью 350 Вт. Окрашивание проводили в автомате Nexes (Ventana Medical Systems; Roche Diagnostics) с использованием кроличьего анти-CD44 (Sigma HPA005785; разведение 1: 200) поликлональных антител в течение 30 мин при 37 ° C, а затем комплекса авидин-биотинпероксидаза и разработан DAB.Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Изображения получали с помощью полностью моторизованного микроскопа (Zeiss Axio Imager Z1; Carl Zeiss, Йена, Германия) с цветной цифровой камерой высокого разрешения (Zeiss HRc) и программным обеспечением AxioVision 4.6.3 SP1.
Анализ экспрессии гена
Концентрацию и целостность / чистоту каждого образца РНК измеряли с помощью набора RNA 6000 LabChip (Agilent) и биоанализатора Agilent 2100. Микроматрицы ДНК, использованные в этом исследовании, представляли собой геном человека U133 Plus 2.0, содержащий 54 675 наборов зондов (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США). Всего было амплифицировано и помечено 100 нг общей РНК в соответствии с протоколом экспрессии Affymetrix 3’IVT. Каждая партия мишеней включала образец MAQC A для контроля подготовки мишени и гибридизации. Мишени были проверены в соответствии с выходом и размером РНК, обычно получаемыми в центре молекулярной биологии Института Кюри. Мишени гибридизовали на микрочипах человека и мыши. Чипы промывали и окрашивали на жидкостной станции в соответствии с протоколом производителя и сканировали с помощью сканера Affymetrix GCS3000.Оценка контроля качества микроматрицы проводилась с использованием пакетов R AffyPLM и SimpleAffy, доступных на веб-сайте Bioconductor. Относительное логарифмическое выражение, нормализованные немасштабированные стандартные ошибки, коэффициент масштабирования, процент «присутствующих» вызовов, соотношение 3 ‘/ 5’ и средние фоновые тесты применялись для определения качества каждого эксперимента. Псевдоизображения чипа были созданы для оценки артефактов на массивах, которые не прошли предыдущие тесты контроля качества. Выбранные массивы были нормализованы в соответствии с процедурой нормализации GC-RMA. 26 Необработанные данные можно получить из базы данных Microarray Института Кюри (http://microarrays.curie.fr/publications/recherche_translationnelle/characterization_of_xenografts/files/AffymetrixData.zip).
Статистический анализ, анализ контроля качества, анализ дифференциальной экспрессии и анализ онтологии генов были выполнены Genosplice Technology (Париж, Франция).
Неагрессивный, высокоэффективный ферментативный метод диссоциации опухолей головного мозга человека и тканей головного мозга на жизнеспособные единичные клетки | BMC Neuroscience
Сравнение качества диссоциации опухолей диспазой, папаином или комбинацией ДНКазы, коллагеназы и / или гиалуронидазы
Первая серия из шести параллельных экспериментов проводилась исключительно на глиальных опухолях.Оценивались ферменты: ДНКаза [4, 9–11], коллагеназа с [4, 11] или без [10] гиалуронидазы, папаин [6, 7] и диспаза [8, 9]. Трипсин не тестировался, поскольку сообщалось, что он вызывает значительную потерю жизнеспособных клеток и расщепление мембранных антигенов [6, 17]. Механическая диссоциация использовалась в этой серии экспериментов в качестве контроля ферментативного пищеварения.
Испытанные диапазоны концентраций ферментов были получены из таблиц данных продукта или из опубликованной литературы с использованием выбранных ферментов.Были оценены следующие диапазоны концентраций: папаин (2–20 ед / мл), диспаза (0,6–2,4 ед / мл), ДНКаза (1–20 ед / мл), коллагеназа (0,02–0,2% мас. / Об.) И гиалуронидаза. (200–4000 ед / мл). Высокие, средние и низкие концентрации каждого фермента оценивали на предмет их диссоциативной способности в течение 30, 60 или 120 минут инкубации или во время инкубации ON. Также были протестированы все комбинации ДНКазы, коллагеназы с гиалуронидазой или без нее в различных концентрациях.
На рис. 1a, b показаны только оптимальные концентрации фермента для каждого фермента / комбинации, которые были определены для длительностей диссоциации 1, 2 ч и ON (30-минутная инкубация дала заметно худшие результаты).Определены оптимальные концентрации ферментов: ДНКаза (5 ед / мл), коллагеназа (0,05%) и гиалуронидаза (1000 ед / мл). Диссоциация с ДНКазой и коллагеназой без гиалуронидазы не показана, поскольку диссоциация с помощью ДНКаза + коллагеназа + гиалуронидаза (DCH) обеспечивала превосходное качество диссоциации и жизнеспособность при сопоставимых концентрациях.
Рис. 1Диссоциация опухоли головного мозга (BT) на отдельные клетки с использованием различных ферментов. a Жизнеспособность клеток и b Накопленная степень диссоциации (CG) для BT, диссоциированных диспазой (Disp), папаином, комбинацией ДНКазы, коллагеназы и гиалуронидазы (DCH), или только механической диссоциацией (нет).См. Текст для расчета ЦТ. Первичные опухоли головного мозга диссоциировали на отдельные клетки в течение 1 часа (1 час), 2 часов (2 часа) или в течение ночи (ON) при оптимальных концентрациях фермента (см. Текст). По истечении указанного времени клетки растирали с помощью пипетки Пастера и определяли их жизнеспособность и CG. Статистика: Жизнеспособность диссоциированных опухолей Disp или DCH по отношению к механически диссоциированным опухолям (P <0,0005 или меньше). CG от Disp-1 ч до отсутствия-1 ч и до DCH-1 ч (также P <0,0001). CG от Disp-2 h до None-2 h и DCH-2 h (P <0.025 либо). CG диспозиции ВКЛ на отсутствие ВКЛ (P <0,0001)
На рис. 1а показан процент жизнеспособных клеток после диссоциации ткани. Жизнеспособность клеток была наивысшей после диссоциации с диспазом. DCH, испытанный в трех экспериментах, показал сопоставимо высокую жизнеспособность. Механическая диссоциация фермента без помощи при растирании суспензии опухоли приводила к значительно более низкой жизнеспособности (P <0,0005) и была прекращена после шести экспериментов. Папаин был прекращен после одного эксперимента, поскольку он давал худшие результаты даже по сравнению с механической диссоциацией, давая очень низкое количество жизнеспособных клеток.
На рис. 1b показано качество диссоциации, оцененное с использованием шкалы CG. В отличие от сравнимой жизнеспособности, производимой диспазой по сравнению с DCH, опухоли, диссоциированные диспазой, продуцировали смеси клеток значительно более высокого качества, чем те, которые были диссоциированы с DCH или с использованием механической диссоциации. Опять же, опухоли, диссоциированные папаином, достигли CG ниже, чем у тех, которые были механически диссоциированы.
В совокупности первоначальная серия экспериментов показывает, что хотя DCH и диспаза давали смеси с сопоставимой жизнеспособностью, качество полученных смесей клеток было значительно выше для диспазы (P <0.0001). Поэтому мы продолжили следующую серию экспериментов только с бесстрастием.
Сравнение диссоциации опухоли с диспазой по сравнению с NP в течение короткого периода времени
После диссоциации в общей сложности 15 опухолей головного мозга и метастазов в головной мозг с помощью диспазы (нейтральная протеаза из Bacillus polymyxa ) мы искали поставщика, предлагающего диспазу клинического уровня которые можно использовать для получения жизнеспособных целых клеток для вакцинации пациентов с глиомой. Поскольку диспаза клинической степени не обнаружена, мы протестировали другую нейтральную протеазу из другого микроорганизма — NP из Clostridium histolyticum (NP), фермент, предлагаемый несколькими компаниями как в клинической, так и в неклинической степени.
На рис. 2a, b сравнивается диссоциация ткани с диспазой и NP. Для краткости сравнивали только оптимальные времена диссоциации с использованием двух ферментов (1 час для диспазы и 2 часа для NP при 37 ° C). Интересно, что хотя диспаза и NP являются нейтральными протеазами (гидролизуют пептидные связи неполярной аминокислоты [29, 33]), они обнаруживают значительные различия в качестве диссоциации. Breite et al. [33] сравнили эти два фермента в бесклеточных анализах in vitro и показали, что они различаются по своей протеолитической активности.
Рис. 2Диссоциация BT на отдельные клетки с использованием диспазы (Disp) или нейтральной протеазы (NP). a Жизнеспособность клеток и b качество диссоциации (CG) BT, диссоциированных диспазой или NP, в оптимальное время диссоциации соответствующего фермента. Через указанные промежутки времени (1 или 2 ч) клетки растирали с помощью пипетки Пастера и определяли их жизнеспособность и CG. Оли — олигодендероглиома, ОлиАст — олигоастроцитома, аст — астроцитома, ГБМ — глиобластома, Mets — метастазы в мозг (легкое — лунка и меланома — мел), Epi + Br — эпилептические очаги и перитуморальная ткань мозга. Круглая скобка указывает степень опухоли, например Оли (2–3). Статистика Жизнеспособность после диссоциации всех глиальных опухолей (Oli, OliAst, Ast, GBM) с использованием NP-2 ч до диспазы-1 ч (P <0,01)
На рис. 2а показано, что NP давали стабильно более высокую жизнеспособность в полученных смесях клеток по сравнению с диспазой для всех типов тестируемых тканей. Комбинируя все диссоциированные глиальные опухоли (11 × диспаза против 15 × NP), NP давала смеси с значительно более высокой жизнеспособностью, чем диспаза (P <0.01), в среднем> 90% клеточной жизнеспособности диссоциированных глиальных опухолей.
Диссоциация с помощью NP также показала неизменно лучшее качество клеточных смесей (рис. 2b). Хотя не было обнаружено значительных различий между оценками CG NP по сравнению с диспазой, оценка параметров CG (сгустки, остатки и липкость) показала, что кратковременная диссоциация с NP дает меньше скоплений клеток и значительно меньше субклеточного дебриса (остатков), чем диспасе (P <0,03). Оба фермента производили смеси клеток, которые обычно не содержали остатков ДНК (дополнительный файл 1: Рисунок S1).
Сравнение качества диссоциации опухоли между диспазой и NP в течение ночи
Лаборатории могут получать ткань из операционной в поздние часы. Разработка протокола диссоциации клеток для увеличения продолжительности диссоциации может позволить инициировать диссоциацию ткани во время приема ткани (например, днем) и завершить ее на следующее утро. Диссоциация при температуре окружающей среды в течение продолжительного времени также может способствовать недорогой воздушной перевозке тканей / опухолей без использования сухого льда.Ткани, собранные на одном участке, будут медленно диссоциировать, а тем временем будут перенесены в центральный участок / лабораторию.
На рис. 3a – d показаны жизнеспособность и качество диссоциации BT и тканей мозга, диссоциированных в течение ночи (ON) либо с диспазой, либо с NP при комнатной температуре. Цифры показывают, что NP или dispase давали смеси аналогичного качества, сравнивая более короткую (1-2 часа) и более продолжительную (ON) продолжительность (дополнительный файл 1: Рисунок S1). Напротив, диссоциация ON с помощью NP приводила к образованию смесей клеток с более высокой жизнеспособностью и лучшим качеством диссоциации, чем при диспазе.
Рис. 3Диссоциация BT на отдельные клетки с использованием диспазы или NP. a Жизнеспособность клеток и b качество диссоциации NP-2 h по сравнению с NP-ON. c Жизнеспособность клеток и d качество диссоциации диспазы-1 ч по сравнению с диспазой-ON. БТ диссоциировали в течение 1–2 ч или ВКЛ. По истечении указанного времени клетки растирали и определяли их жизнеспособность и CG. Статистика Жизнеспособность диссоциированных клеток и качество диссоциации не различались для всех глиальных опухолей между NP 2 ч и NP-ON или между диспазой 1 ч и диспазой-ON
Другие методы диссоциации ON, такие как диссоциация при 37 ° C или поддержание измельченной, но недиссоциированной опухоли при 4 ° C ON, а затем диссоциация опухоли при 37 ° C в течение 1-2 часов, оба дали более низкую жизнеспособность клеток и качества диссоциации, чем ВКЛ диссоциация при температуре окружающей среды (не показана).
Выходы жизнеспособных клеток после диссоциации ткани с использованием диспазы или NP
Сравнивали выходы клеток после диссоциации ткани GBM с помощью образцов NP или диспазы. Поскольку разные опухоли содержат разное количество клеток, диспаза и NP сравнивались только для ткани GBM, в которой было достаточное количество образцов для сравнения. Аналогичный выход жизнеспособных клеток на грамм ткани GBM был получен с помощью диспазы (6,2 ± 4,1 × 10 7 клеток (N = 6)) и NP (7,6 ± 4,3 × 10 7 клеток (N = 9)) (P = 0.54).
Таблица 1 суммирует выход жизнеспособных клеток от всех диссоциаций глиальных опухолей, метастазов в головной мозг и образцов ткани мозга с использованием диспазы и NP, всего 47 диссоциаций. Таблица объединяет данные диспазы и диссоциированных NP тканей, имеющих аналогичный выход клеток, для получения более крупных размеров выборки и, таким образом, более точных оценок выхода клеток. Высокая естественная изменчивость клеточных выходов БТ может быть оценена по большому количеству клеток на грамм ткани даже в опухолях той же степени.Средний выход жизнеспособных клеток на грамм анапластических астроцитом (степень III) составлял 1,35 × 10 8 , в то время как GBM (астроцитомы степени IV) давали примерно половину этих чисел (7,3 × 10 7 клеток / г). Меланомы и легочные метастазы в головной мозг дали 6,4 × 10 7 клеток / г, а неопухолевая ткань мозга принесла 1,15 × 10 8 клеток / г в эпилептических очагах до 2,89 × 10 8 клеток / г в перитуморальном мозге. Различия между двумя типами неопухолевой ткани головного мозга, вероятно, связаны с разными областями мозга, из которых были взяты образцы, но также могут быть из-за небольшого размера образца этих редких образцов ткани.
Таблица 1 Выход жизнеспособных клеток диссоциированных опухолей головного мозга и мозговой тканиЗамораживание и оттаивание диссоциированных клеток головного мозга / опухоли
Значительное снижение количества клеток, восстановленных после замораживания и оттаивания, является известным явлением для клеток мозга [34, 36]. На рисунках 4a, b показана судьба клеток мозга и BT, диссоциированных с помощью NP, замороженных и размороженных с использованием стандартных процедур замораживания [34]. На рис. 4а показано, что после оттаивания доля жизнеспособных клеток BT снизилась с 91 до 72%; скорость восстановления клеток (т.е.е. количество извлеченных живых клеток, разделенное на количество замороженных) составило 69%. Доля жизнеспособных клеток головного мозга снизилась с 84 до 75%, при этом восстановление клеток составило 96%. Эти показатели восстановления выше, чем ранее сообщалось для клеток мозга человека (55–60% [34]) или крыс (56%) [36].
Рис. 4Жизнеспособность клеток и CG свежедиссоциированных клеток по сравнению с размороженными клетками. BT или ткань мозга диссоциировали с использованием NP и оценивали по жизнеспособности, восстановлению ( a ) и качеству диссоциации ( b ) сразу после диссоциации NP или после замораживания и оттаивания (размораживание — DF).Жизнеспособность клеток и CG определяли с использованием трипанового синего
.На рис. 4b показано качество диссоциации ткани головного мозга или смесей клеток BT до замораживания и после оттаивания, не показывая значительных изменений. По нашему опыту, смеси клеток с низким качеством диссоциации перед замораживанием обычно связаны с более низким выходом восстановленных клеток после оттаивания.
Дебрис ДНК значительно снижает выход клеток после оттаивания, поэтому в смесях с более низким качеством диссоциации добавление ферментов, гидролизующих ДНК, таких как ДНКаза или бензоназа, в среду оттаивания является оправданным.
Мониторинг жизнеспособности клеток с использованием красителя для определения жизнеспособности FCM и метода исключения трипанового синего
Жизнеспособность диссоциированных клеток может быть оценена либо микроскопически с использованием исключения красителя, либо проточно-цитометрически с использованием красителя жизнеспособности [35, 37]. Красители жизнеспособности, которые различают живые и мертвые клетки, часто интегрируются в панели для окрашивания антител; антитела неспецифически связываются с мертвыми клетками и могут генерировать основные артефакты FCM [24, 38]. Здесь для определения жизнеспособности клеток использовали фиксируемый краситель жизнеспособности амина (ViViD), который окрашивает аминогруппы [24, 38].
На рис. 5а изображен образец диссоциированного GBM, серийно проверенный на жизнеспособность. Первые два гейта удаляют дублетные и слипшиеся клетки, вводя только синглетные клетки (sin) [35]. Следующие два строба удаляют чрезмерно окрашенные клетки или клетки большого размера, лежащие на дальних осях; эти клетки вносят артефакты в анализ проточной цитометрии [35, 38]. Следующая точечная диаграмма различает мертвые (ViViD , высокий ) и живые (ViViD , низкий ) клетки. Последние два точечных графика показывают, что невозможно различить живые и мертвые клетки опухоли (или мозга) человека, основываясь только на их графиках FSC / SSC, методе, ранее использовавшемся в FCM для определения жизнеспособности.
Рис. 5Сравнение трипанового синего и проточной цитометрии для определения жизнеспособности клеток. a Клетки, диссоциированные из образца GBM, окрашенные ViViD, красителем для определения жизнеспособности аминов, и проанализированные проточной цитометрией ( b ) фотографии диссоциированных ( c ) клеток мозга и ( d ) клеток BT, окрашенных с использованием трипанового синего. d Корреляция между процентом жизнеспособности, определенной трипановым синим (среднее значение = 77%) и проточной цитометрией (среднее значение = 75%), изображено шестнадцать образцов
На рис. 5b, c представлена микроскопическая оценка жизнеспособности и качества диссоциации.Смеси представляли собой механически диссоциированный мозг (5b) и образцы BT (5c) с низким качеством диссоциации, выбранные для иллюстрации множества визуально идентифицируемых проблем качества диссоциации. На рис. 5b, на котором изображена диссоциированная ткань мозга, окрашенная трипановым синим, представлены следующие объекты: Живые клетки — обычно неправильной формы, с блестящим телом и светлым ореолом вокруг них. Мертвые клетки — неправильной формы, с более темным телом. RBC — круглые клетки, меньше всех остальных клеток. Sub — клеточный мусор — очень мелкий, обычно темный. Группы — несколько клеток, сгруппированных вместе.
На рис. 5с изображена глиома высокой степени злокачественности, окрашенная трипановым синим, представляющая следующие объекты: живые клетки, мертвые клетки, субклеточные остатки, эритроциты и остатки ДНК — полупрозрачные нити, в которых переплетены клетки. Визуальное различие между живыми и мертвыми клетками обычно труднее с тканями мозга, чем с BT. Параллельное окрашивание лейкоцитов, передающихся с кровью, трипановым синим помогает идентифицировать и количественно определять жизнеспособные клетки.
На рис. 5d сравнивается процент жизнеспособных клеток для 16 образцов, жизнеспособность которых оценивалась параллельно трипановым синим и FCM. Образцы состоят из 12 БТ и 4 образцов ткани головного мозга. Средняя жизнеспособность, определенная трипаном, составила 77 и 75% по FCM (P = NS). В то время как при высокой жизнеспособности процент жизнеспособных клеток, оцененных любым методом, был одинаковым, в других случаях методы давали несколько различающиеся подсчеты жизнеспособности — без какой-либо последовательности для одного метода переоценки жизнеспособности.
Диссоциация | Химия для неосновных
Цели обучения
- Определите диссоциацию.
- Уметь писать уравнения диссоциации ионных соединений.
Вы когда-нибудь видели, чтобы грузовики сыпали соль на обледеневшие дороги?
Бегущий по замерзшей дороге. Предоставлено FEMA.
Во многих районах лед на улицах и тротуарах представляет серьезную опасность при ходьбе и вождении. Один из распространенных способов растапливать лед — это нанести на поверхность некоторую форму противообледенительной соли.Для этой цели часто используются такие материалы, как хлорид натрия или хлорид кальция. Чтобы быть эффективным, твердый материал должен сначала раствориться и распасться на ионы, составляющие соединение.
Диссоциация
Ионная кристаллическая решетка распадается при растворении в воде. Диссоциация — это разделение ионов, которое происходит при растворении твердого ионного соединения. Важно уметь писать уравнения диссоциации. Просто отмените метод перекрещивания, которому вы научились при написании химических формул ионных соединений.Индексы для ионов в химических формулах становятся коэффициентами соответствующих ионов на стороне произведения уравнения. Ниже показаны уравнения диссоциации для NaCl, Ca (NO 3 ) 2 и (NH 4 ) 3 PO 4 .
NaCl ( с ) → Na + ( водн. ) + Cl — ( водн. )
Ca (NO 3 ) 2 ( водн. ) → Ca 2+ ( водн. ) + 2НО 3 — ( водн. )
(NH 4 ) 3 PO 4 ( с ) → 3NH 4 + ( водн. ) + PO 4 3- ( водн. )
Формульная единица хлорида натрия распадается на один ион натрия и один ион хлорида.Формульная единица нитрата кальция распадается на один ион кальция и два иона нитрата. Это из-за заряда 2+ иона кальция. Два нитрат-иона, каждый с зарядом 1-, необходимы, чтобы сбалансировать уравнение электрически. Формульная единица фосфата аммония распадается на три иона аммония и один ион фосфата. Обратите внимание, что сами по себе многоатомные ионы не диссоциируют, а остаются нетронутыми.
Не путайте нижние индексы атомов в многоатомном ионе с нижними индексами, которые возникают в результате пересечения зарядов, которые делают исходное соединение нейтральным.Нижний индекс 3 нитрат-иона и нижний индекс 4 иона аммония являются частью многоатомного иона и просто остаются как часть его формулы после диссоциации соединения. Обратите внимание, что соединения представляют собой твердые вещества ( s ), которые затем становятся ионами в водном растворе ( водн. ).
Рис. 1. Нитрат кальция — типичное ионное соединение. В водном растворе диссоциирует на ионы кальция и ионы нитрата. Ондржей Мангл.
Неэлектролиты не диссоциируют при образовании водного раствора.Еще можно написать уравнение, которое просто показывает переход твердого вещества в раствор. Для растворения сахарозы:
C 12 H 22 O 11 ( s ) → C 12 H 22 O 11 ( водн. )
Сводка
- Диссоциация — это разделение ионов, которое происходит при растворении твердого ионного соединения.
- Неионные соединения не диссоциируют в воде.
Практика
Воспользуйтесь ссылкой ниже, чтобы ответить на следующие вопросы:
http: // www.chemistrylecturenotes.com/html/dissociation_of_ionic_compound.html
- Что образует нитрат серебра при диссоциации в воде?
- Как HCl диссоциирует в воде?
- Является ли HF первично диссоциированным или недиссоциированным в воде?
- Диссоциируют ли спирты в воде?
Обзор
- Определите диссоциацию.
- Диссоциируют ли многоатомные ионы при растворении в воде?
- Напишите уравнение диссоциации KBr в воде.
- Напишите уравнение диссоциации NH 4 Cl в воде.
Глоссарий
- диссоциация: Разделение ионов, которое происходит при растворении твердого ионного соединения.
| Thermo Fisher Scientific
Почему во время масс-спектрометрии требуется диссоциация молекул?
Чтобы лучше понять структурный состав молекулы, и особенно более крупной молекулы, такой как пептид, для ее расщепления используется метод диссоциации (т.е. вызвать фрагментацию) на более мелкие составляющие перед масс-спектрометрией. В результате один большой пик m / z , который должен был возникнуть в результате масс-спектрального анализа молекулы, вместо этого становится набором из двух, трех или более пиков. Эти дополнительные пики действуют как «отпечатки пальцев» молекулы, помогая подтвердить такие характеристики, как молекулярные группы и метки, состояния окисления и продукты разложения.
В диагностических и прикладных лабораториях для подтверждения идентичности соединения можно использовать несколько последовательных процессов диссоциации.Например, биологические образцы, проверяемые на метаболиты кокаина, обычно проходят несколько циклов молекулярной диссоциации в лабораториях судебной токсикологии.
Какие процессы молекулярной диссоциации используются?
За прошедшие годы были разработаны различные методы диссоциации масс-спектрометрии. Большинство этих методов полагаются на конкретный масс-анализатор. Некоторые методы сочетаются с отдельными процессами ионизации.
- Диссоциация, индуцированная столкновением (CID) или диссоциация, активируемая столкновением (CAD): Часто используемый вместе с GC-MS, CID, который также называется CAD, относится к процессу, при котором ион и нейтральные частицы ( е.g., гелий, азот, аргон) сталкиваются, и энергия этого столкновения передается внутренней энергии иона, что приводит к разрыву связи и фрагментации. Затем эти фрагменты ускоряются в направлении масс-анализатора. Затем молекулярные и / или атомные фрагменты покидают коллизионную ячейку и анализируются детектором. Масс-спектрометры
с тройным квадруполем (QQQ) используют CID для фрагментации образцов на их основные компоненты. Первый Q (Q1) тройного квадруполя обычно состоит из фильтра масс, который выбирает данный ион и ускоряет его по направлению к ячейке столкновения (Q2) спектрометра.Здесь ион фрагментирован. После выхода из Q2 диапазоны масс фрагментов сканируются третьим квадруполем (Q3).
- Высокоэнергетическая диссоциация C-ловушкой (HCD): HCD относится к варианту CID, который использует более высокое высокочастотное напряжение для удержания ионов фрагментов в C-ловушке. Ячейка HCD используется для фрагментации ионов, после чего они ускоряются, охлаждаются и хранятся внутри C-ловушки. Затем ионы вводятся и разделяются внутри орбитальной ловушки в зависимости от разницы их частот вращения.На схеме, показанной ниже, показаны ячейка HCD, C-ловушка и масс-анализатор Orbitrap.
Почему существует несколько методов молекулярной диссоциации?
Различные размеры молекул и состояния ионизации, а также доступные технологии, такие как масс-анализаторы, привели к различным процессам диссоциации, чтобы лучше всего вызвать фрагментацию. Более мелкие молекулы часто могут быть успешно фрагментированы с помощью CID, в то время как более крупные молекулы, такие как пептиды и белки, лучше подходят для анализа с помощью ETD.В таких областях, как протеомика, необходимо использовать несколько методов диссоциации для характеристики сложных белков, которые содержат обширные разветвления и связи.
Диссоциация одиночных клеток Caenorhabditis elegans: метод выделения живых клеток
— Начните с промытых гранулированных червей и добавьте буфер для лизиса, содержащий SDS, детергент и DDT, восстанавливающий агент. Это разрушает защитную кутикулу червя, подвергая тело диссоциации клеток. Избегайте длительного воздействия буфера для лизиса, чтобы минимизировать лизис и гибель клеток.
Затем удалите реагенты для лизиса несколькими промывками холодным буфером для изоляции. Важно, чтобы этот буфер имел правильную осмолярность, чтобы предотвратить гибель клеток. Используйте фермент протеазу для разрушения межклеточных связей. Помогите процессу гомогенизации наряду с механической энергией, нанося смесь пипеткой на стенку пробирки.
Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить ферментативную реакцию, и антибиотики, чтобы предотвратить заражение. Гранулируйте и промойте образец несколько раз, чтобы удалить большую часть мусора.
Наконец, поместите пробирку на лед, чтобы обеспечить осаждение под действием силы тяжести. Мусор, включая остатки кутикулы или скопления клеток, оседает, в то время как диссоциированные клетки остаются взвешенными в верхнем слое среды. Эти клетки можно использовать для краткосрочного культивирования или для выделения определенных популяций клеток с помощью FACS или иммунопреципитации.
В примере протокола мы будем диссоциировать трансгенных червей, экспрессирующих GFP, в нейронах, представляющих интерес, чтобы изолировать и проанализировать эти клетки.
— После сбора животных центрифугируйте их при 1600 раз g в течение пяти минут.Удалите весь супернатант и повторно суспендируйте червей в 1 миллилитре среды M9. Перенести суспензию в 1,5-миллилитровую пробирку для микроцентрифуги.
Центрифуга при 1600 g в течение пяти минут для осаждения червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DDT и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Теперь черви должны выглядеть морщинистыми вдоль тела, если смотреть под световым микроскопом.
Затем добавьте 800 мкл ледяного изоляционного буфера и перемешайте, осторожно взмахнув пробиркой.Центрифуга при 13000 раз g и 4 градусах Цельсия в течение одной минуты для осаждения червей. Удалите супернатант и промойте 1 миллилитром изоляционного буфера.
Повторите процесс центрифугирования и промывки всего пять раз, каждый раз аккуратно удаляя буфер для изоляции. После этого к осадку добавляют 100 микролитров смеси протеаз из Streptomyces griseus , растворенной в буфере для изоляции.
Инкубируйте при комнатной температуре от 10 до 15 минут.Убедитесь, что вы применили механическое разрушение, пипетируя вверх и вниз от 60 до 70 раз с кончиком микропипетки на 200 микролитров напротив дна пробирки. Чтобы определить стадию переваривания, удалите от 1 до 5 микролитров перевариваемой смеси, капните ее на предметное стекло и исследуйте с помощью микроскопа для культивирования тканей.
По прошествии пяти-семи минут на фрагментах червя должна быть заметно уменьшенная кутикула, и будет хорошо видна суспензия клеток. Остановите реакцию, добавив 900 микролитров коммерчески доступной среды L15 Лейбовица с добавлением 10% FBS и пенициллин-стрептомицина.
Центрифуга при 10000 раз g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут для осаждения изолированных фрагментов и клеток. Промыть осажденные клетки еще дважды холодной средой с добавлением L15, используя 1 миллилитр среды на промывку.