Категории по интересам:

Мартышка. Ольги Троицкой | Тедсби

Платежная политика

Какие способы оплаты поддерживает Tedsby?

Мы поддерживаем все основные кредитные карты: Visa, MasterCard, American Express и Discover через PayPal. На странице оформления заказа вы можете выбрать оплату кредитной картой или PayPal. PayPal также принимает все основные кредитные карты.

Обратите внимание, что если у вас нет учетной записи PayPal, выберите «Оплатить дебетовой или кредитной картой». вариант, и они просто попросят данные вашей кредитной карты.PayPal будет НЕ попросить вас создать аккаунт для оплаты.

Почему меня перевели на сайт PayPal?

После того, как вы нажмете кнопку «Купить сейчас», вы будете безопасно переведены на PayPal. PayPal предлагает дополнительную защиту как для клиента, так и для исполнителя.

Политика доставки

Отправляю посылки в любую точку мира.
Я хорошо упаковываюсь.
Доставка ЕМС Почтой России. Способ доставки составляет около 10-20 дней, номер отслеживания я предоставляю.

Политика возврата

За многолетний опыт — без возврата денег.

Автор обзора Гейл Б.
США, на Июл 16, 2021

Прекрасный мишка! Мне нравятся его глаза, его плюш, работа вышивки сделана так хорошо, он ЗАМЕЧАТЕЛЬНЫЙ! Очень красивая упаковка ~ спасибо! Я так рада, что он в моей коллекции! Прибыл очень быстро в Калифорнию, США! 💘🐻🧸

Автор обзора Сью С.
США, на Май 25, 2021

ВАУ !!!!! Совершенство! Я оооочень влюблен в этого медведя! Очень нравится мех, кор, серые глаза и кропотливая вышивка крестиком шмеля !!!!! Он просто идеален! Моя вторая мишка от этой художницы вышивает крестиком, что, как я знаю, требует много времени и у нее фантастическая работа !!!! 💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖💖

Автор обзора Сью С.
США, на Октябрь 30, 2019

Милый медведь! Очень нравится всем вышивка крестиком и его мордашка! Так рада, что удочерила его !!!
Большое спасибо !!!!! Фантастический медведь !!!!!!

Спасибо за прекрасный обзор)))
Ольга Троицкая

Ольга Троицкая

Аутофагия — это деградационный процесс, в котором клеточные органеллы и белки повторно используются для восстановления гомеостаза и клеточного метаболизма.Аутофагия может быть процессом выживания или смерти и остается одним из самых фундаментальных процессов жизнеспособности клеток. Таким образом, модуляция аутофагии является важным подходом к усилению противоопухолевой терапии. Ранее мы продемонстрировали, что рекомбинантный аналог белка грудного молока лактаптин (RL2) индуцировал апоптоз различных культивируемых раковых клеток и активировал липидирование легкой цепи 3 (LC3), ассоциированного с микротрубочками белка 1. В этом исследовании мы исследовали, могут ли ингибиторы аутофагии — хлорохин (CQ), Ku55933 (Ku) и 3-метиладенин (3MA) — или индуктор — рапамицин (Rap) — усиливать цитотоксическую активность аналога лактаптина в раковых клетках и его противораковую активность в модель мышей.Вестерн-блоттинг показал, что RL2 индуцировал кратковременную аутофагию в клетках MDA-MB-231 и MCF-7 на ранних стадиях инкубации, и что эти данные были подтверждены просвечивающей электронной микроскопией образования аутофагосом / аутофаголизосом. RL2 стимулирует продукцию активных форм кислорода (ROS), накопление аутофагосом, активацию ATG5 с процессингом LC3I до LC3II и подавление p62 / секвестосомы 1 (p62). Мы показали, что модуляторы аутофагии, CQ, Ku и Rap, синергетически увеличивают цитотоксичность RL2 и RL2 с CQ, вызывая гибель аутофагических клеток.Кроме того, CQ, Ku и Rap в сочетании с RL2 снижали активность лизосомальной протеазы катепсина D. Что еще более важно, комбинируя RL2 с CQ, мы улучшали противоопухолевый эффект у мышей. Обнаруженные синергические цитотоксические эффекты обоих типов регуляторов, ингибиторов и индукторов аутофагии с RL2 против раковых клеток позволяют нам полагать, что эти комбинации могут быть основой для нового противоракового подхода. Наконец, мы предполагаем, что CQ и Rap, способствующие краткосрочной RL2-индуцированной аутофагии, взаимосвязаны с окончательной гибелью аутофагических клеток.

Анастасия Васильевна Багаманшина; Ольга Сергеевна Троицкая; Анна А. Нуштаева; Анастасия Юнусова; Марина Старикович; Елена В. Кулигина; Юрий Я Кит; Макс Рихтер; Фабиан Вольфромм; Тило Кане; Инна Николаевна Лаврик; Владимир А. Рихтер; Ольга Анатольевна Коваль. Цитотоксическая и противоопухолевая активность лактаптина в сочетании с индукторами и ингибиторами аутофагии. BioMed Research International 2019 , 2019 , 1-16.

Анастасия В.Багаманшина, Ольга Сергеевна Троицкая, Анна А. Нуштаева, Анастасия Юнусова, Марина Старикович, Елена В. Кулигина, Юрий Я Кит, Макс Рихтер, Фабиан Вольфромм, Тило Кяхне, Инна Н. Лаврик, Владимир А. Рихтер, Ольга А. Коваль. Цитотоксическая и противоопухолевая активность лактаптина в сочетании с индукторами и ингибиторами аутофагии. BioMed Research International. 2019; 2019 (): 1-16.

Анастасия Васильевна Багаманшина; Ольга Сергеевна Троицкая; Анна А.Нуштаева; Анастасия Юнусова; Марина Старикович; Елена В. Кулигина; Юрий Я Кит; Макс Рихтер; Фабиан Вольфромм; Тило Кане; Инна Николаевна Лаврик; Владимир А. Рихтер; Ольга Анатольевна Коваль. 2019. «Цитотоксическая и противоопухолевая активность лактаптина в сочетании с индукторами и ингибиторами аутофагии». BioMed Research International 2019, нет. : 1-16.

Быть или не быть

Спустя несколько поколений появился интерес к старинным русским усадьбам, но их возрождение порой является лишь продолжением драматической истории начала прошлого века.Примером тому является усадьба участника Отечественной войны 1812 года Георгиевского генерала Александра Яковлевича Мирковича в селе Николо-Жупан близ Одоева в Тульской области.

Особняк — на картошку

Дом генерала Александра Яковлевича Мирковича — исторический памятник федерального значения … Удивительная по красоте и гармонии усадьба, расположенная на высоком берегу реки Упа, является памятником архитектуры середины XIX века. История особняка во многом типична.После революции большевики вынудили наследников генерала покинуть дом, а на освободившемся помещении была открыта школа крестьянской молодежи. В 1930-е годы было решено закрыть школу и организовать писательский дом отдыха. Здесь были Серафимович, Лавренев, Тренев, Борис Пастернак жил в 1934 году.

После войны имение передали детскому дому. Когда для детей построили новый корпус, старый дом превратился в общежитие для сотрудников. В 1990-е годы районные власти зарегистрировали здесь беженцев, а в подвале устроили овощехранилище и котельную.Оставшееся топливо вылили во двор. Спустя полвека наследникам пришлось вывезти отсюда 27 грузовиков КамАЗ с угольной крошкой.

Как все начиналось

О том, что ее предок в пятом поколении — генерал, участник Бородинской битвы и заграничных командировок русской армии, Ольга Троицкая-Миркович неожиданно узнала, когда работала в архивах, выясняя судьбу расстрелянного деда. во время сталинских репрессий… Потом восемь лет ушло на то, чтобы собрать и подписать все бумаги, подтверждающие ее права на имение.

Летом 2005 года было решено передать дом потомкам в бесплатное пользование сроком на 49 лет (приватизировать памятники тогда было невозможно). Для этого Мирковичам было предложено создать предприятие, на баланс которого можно было бы перенести ветхую экономику. Так появилась некоммерческая организация «Культурный центр« Усадьба генерала Мирковича ».

За год сделали косметический ремонт и открыли первую выставку, посвященную истории генеральской семьи, в которой, как зеркало, отражена история России: среди присутствующих на стендах имен Демидовы, Чичерены, Сухово- Кобылин, Муравьев-Амурский. В книге памяти зарождающегося музея есть пометка Евгения Борисовича Пастернака: «Очень хорошо, что есть люди, находящие в себе силы возродить то, что было утрачено в страшные годы безвременья, стерли исторические корни с лица земли. .Я в форме семьи Ольги Серафимовны Миркович, которая решила поднять дом своих предков из руин. «

Все эти годы Троицкая-Миркович собирает и изучает исторические материалы и различные предметы, связанные с усадьбой, пишет статьи, издает книги, ее приглашают читать лекции на различных форумах и конференциях. Сейчас в этом музее уже более трех тысяч экспонатов, есть даже роскошный белый рояль.Дом Мирковича сегодня стал одним из брендов Тульской области, он вошел в проект «Русские усадьбы».

Вот так поддержали!

Десять лет назад региональные власти обещали всяческую помощь. Власти района хранили молчание. Региональные пошутили и забыли, и Мирковичи наконец поняли, что означает это молчание муниципалитетов. Дело в том, что договор безвозмездного пользования был заключен с обременением: в доме жили люди, а жильцы «не должны мешать проживанию жильцов до тех пор, пока они не будут переселены на законных основаниях.«Правда, как выяснила прокуратура, этот дом никогда не принадлежал жилому фонду, и местная администрация не имела права регистрировать в нем людей. Несмотря на все обещания и незаконность, люди до сих пор не заселены. Только в этом году женщина с младенцем была выписана, и мужчина, вернувшийся из тюрьмы, до сих пор числится по этому адресу.

Сегодня региональные представители культуры заявляют, что присутствие арендаторов не помешало реставрации здания. Только сами жители постоянно угрожали, что приватизируют свои комнаты.И какой спонсор согласится вложить деньги в реставрацию в такой ситуации? Более того, несмотря на то, что территория памятника так и не была официально оформлена — все попытки сдать землю в аренду местными властями бойкотировались.

Особняк Мирковича сегодня стал одним из брендов Тульской области

Мы взяли усадьбу не как дачу, а собрали экспонаты в музей, — поясняет Ольга Серафимовна. — Был круг людей, готовых профинансировать реставрацию.Они все еще существуют, но при условии оформления земли под постройку. Федеральным законом № 73-ФЗ установлено, что земельные участки в границах объектов культурного наследия являются землями историко-культурного значения. Нам не нужны участки и постройки, сданные в аренду детскому дому на неограниченный срок. Но почему они не позволяют нам выдать остальное? Реконструкция уцелевших хозяйственных построек позволит потенциальным инвесторам создать инфраструктуру для развития туристического комплекса параллельно с культурно-историческим проектом «Усадьба генерала Мирковича».

Мирковичи собственными силами очистили подвалы, отремонтировали канализацию и котельную. Но трубу снова сложили и списали. Лестницу к реке разобрали. В довершение ко всему, директор интерната решил сделать стадион в пяти метрах от западного крыла дома — земля его. К тому времени, когда это удалось остановить, они успели засыпать участок песком и срубить реликтовые бальзамические тополя, которые еще в прошлом веке специалисты Никитского ботанического сада признали памятниками природы.Но что я могу сказать, в тот день, когда мы приехали в имение, нам пришлось тащить от двери огромные бревна (остатки тех тополей) — они были перевернуты, чтобы женщина не могла выйти из дома. Хорошо, она ушла, чтобы встретить нас.

Такова битва за этот примитивный по своей подлости дом, — рассказывает жительница Одоевой Тамара Лепешова. — Все исторические здания в Одоеве распроданы. Из всех непроданных осталось только это имение. Сколько таких примеров при покупке домов ради земельного участка: застройщик ждет, когда они развалятся, чтобы построить что-то свое.

Стоит ли ждать помощи?

Новый виток борьбы с потомками владелицы усадьбы, но уже на региональном уровне, начался совсем недавно — после того, как она вошла в проект «Русские усадьбы». Троицкой-Миркович инкриминировали отказ от ремонта дома. Был суд, ее оштрафовали на 300 тысяч рублей. Тогда региональные министры культуры и имущественных отношений предложили ей «по-хорошему уйти». В противном случае договор будет расторгнут в судебном порядке.

Прописаны охранные обязательства и обязательства по восстановлению усадьбы, — пояснила министр культуры Тульской области Татьяна Рыбкина. — В течение пяти лет должен быть представлен проект реставрации, в течение десяти лет — обязательства по приведению усадьбы в порядок выполнены. Все сроки прошли. В последние два года имение стало просто физически разрушаться. Мы поддерживали Ольгу Серафимовну, всегда приглашали ее на выставки. Отдам должное, что касается продвижения бренда, у нее это очень хорошо получается.Благодаря ей усадьба входит в культурное наследие региона. Но что бы ни говорили, имение начало разрушаться.

По словам Ольги Троицкой-Миркович, ей сказали, что с помощью «народного бюджета» можно выделить 50 миллионов рублей на восстановление усадьбы. Половина суммы — средства областной казны, 30 процентов предоставит муниципалитет, пять миллионов — она. Но для этого усадьба должна перейти в муниципальную собственность.

Местные активисты уверены, что причина всему — возможность «собрать» большие деньги, а чиновникам здесь не нужны наследники.Скептически относятся к разговорам о «народном бюджете»: в селе рушится водонапорная башня, нет освещения, есть проблема с канализацией, будут ли люди голосовать за восстановление усадьбы?

Она просто физически не способна все это воспитать — не меценат, не богатый человек. В то же время это человек, который очень хорошо знает историю семьи, собрал много интересных экспонатов, — поясняет Татьяна Рыбкина. — Я бы не хотел, чтобы эта усадьба была целиком и полностью инвестиционным проектом, который отдадут инвестору, например, как отель.Часть его обязательно нужно музеефицировать. Но финансовая ситуация такова, что у региона, особенно у муниципалитета, нет средств для полного восстановления усадьбы. Наверное, это будет совместный проект. Там возможен частный бизнес.

В этой схеме Ольге Троицкой-Миркович в лучшем случае отводится роль привратника собранному ею музею. Неудивительно, что она возмущена этим. Ведь есть уже разработанный творческий проект, есть потенциальные инвесторы, но у властей вроде бы свои предпочтения.

Усадьба генерала А.Я. Миркович

Проект создания культурного центра «Усадьба генерала А.Я. Мирковича» в Одоевском районе Тульской области поддержан на заседании Общественного совета по содействию Государственной комиссии в рамках подготовки к празднованию 200-летия со дня рождения. Победа России в Отечественной войне 1812 г. (см .: Протокол собрания № от 2 марта 2011 г.). Инициатор проекта О.С.Троицкая-Миркович, входила в Общественный совет.

Сведения об имении генерала Мирковича

В Одоевском районе Тульской области, в селе Николо-Жупан, находится старинная русская усадьба, вошедшая в историю Тульского края как имение генерала Мирковича.

Решением облисполкома № 6-294 от 9 апреля 1969 года усадьба признана памятником истории и культуры местного значения, а с 1995 года Указом Президента Российской Федерации (№176 от 20 февраля 1995 г.) — памятник истории и культуры федерального значения.

Во времена царя Ивана Грозного село было вотчиной бояр Стрешневых. В конце XVIII века он перешел к семье Чичериных: генерал-майору Александру Николаевичу с женой Елизаветой Петровной, урожденной Демидовой, внучкой Григория Акинфиевича Демидова, одного из крупнейших производителей железа и меди, создателя первого научно-ботанического сад в России под Соликамском.Ее отец, Петр Григорьевич Демидов (1740 — 1826), с 1800 года в течение пяти лет занимал должность главного директора Петербургского коммерческого училища.

Сама Елизавета Петровна известна как переводчик и писатель. Это имя вошло в словарь русских писателей 18 века. Ее дочь Екатерина Александровна Чичерина вышла замуж за Александра Яковлевича Мирковича (1792 — 1888) в 1822 году. От этого брака в 1828 году родился сын Александр. Екатерина Александровна умерла в 1848 году в возрасте 58 лет.

В 1851 году Александр Яковлевич Миркович завершил строительство главной усадьбы.

Некоторые представители рода Чичериных-Мирковичей нашли свой покой в ​​сохранившемся до наших дней приделе Никольского храма во имя святого благоверного князя Александра Невского, организаторами которого они были.

До 1917 года имением владели потомки этой семьи.

Тогда в усадьбе размещалась школа крестьянской молодежи, а с 1932 года — Дом отдыха Союза писателей.Здесь отдыхали Б.Л. Пастернак и многие другие известные писатели.

В Доме Мирковича с 1953 по 1974 год размещался детский дом … Позже мемориальное здание использовалось как общежитие для сотрудников детского дома.

С августа 2005 года памятник истории и культуры федерального значения передан в бесплатное пользование на 49 лет АНО «Культурный центр« Усадьба генерала Мирковича »для создания в нем мемориального музея Героя Отечественной войны 1812 года, участник. в заморских походах 1813-1814 гг. участник Бородинского сражения генерал-майор, кавалер св.Георгий Александр Яковлевич Миркович. Основатели культурного центра — его прямые потомки.

В 2001 году на здании памятника установлена ​​мемориальная доска следующего содержания: «Памятник истории и культуры федеральных (общероссийских) ценностей XIX века« Усадьба генерала Мирковича А.Я. ». (02.02.1792 — 22.06.1888), герой Отечественной войны 1812 года, участник Бородинского сражения и заграничных походов русских войск (1813–1814), кавалер Св.Джордж. Здесь с 1932 по 1936 год располагался Дом отдыха писателей, где жили и работали писатели А. Серафимович, Н. Тренев, поэт Б. Пастернак. Охраняется государством. Мемориальная доска установлена ​​4 июля 2001 года благодарными потомками генерала А.Я. Миркович. «

В усадьбе приняты комплексные меры по сохранению дома и защите его от проникновения посторонних лиц. Были проведены аварийно-спасательные работы, чтобы остановить дальнейшее разрушение здания.В настоящее время разрабатываются проект реставрации памятника и согласование проекта границ территории и охранных зон памятника. В одном из залов главного дома усадьбы создана предварительная экспозиция, рассказывающая об истории усадьбы и ее владельцах.

С 2005 года, в День города Одоева, усадьба держит свои двери «распахнутыми». Для школьников района посещение усадьбы также стало традицией: в мае — после окончания учебного года, в сентябре — на празднике. Начало тренировочного сезона ко Дню Бородинского сражения, в котором принял участие владелец усадьбы Александр Яковлевич Миркович.

В мае 2008 года учредители Культурного центра были удостоены Национальной премии «Культурное наследие» за заслуги в сохранении, возрождении и популяризации архитектурного наследия России, а в 2009 году — благодаря Министру культуры Российской Федерации.

Село Николо-Жупан Одоевского района известно многим любителям старины благодаря находящемуся здесь дворцу, вошедшему в историю Тульской области под названием «Усадьба генерала Мирковича».Сегодня эта усадьба является памятником истории и культуры федерального значения.

Усадьба стала памятником истории федерального значения еще в 1995 году, в 2001 году на здании была установлена ​​мемориальная доска следующего содержания: «Памятник истории и культуры федерального (общероссийского) значения XIX века. «Усадьба генерала Мирковича А.Я. »(02.02.1792 — 22.06.1888), герой Отечественной войны 1812 года, участник Бородинского сражения и заграничных походов русских войск (1813–1814), кавалер Св.Джордж. Здесь с 1932 по 1936 год располагался Дом отдыха писателей, где жили и работали писатели А. Серафимович, Н. Тренев, поэт Б. Пастернак. Охраняется государством. Мемориальная доска установлена ​​4 июля 2001 года благодарными потомками генерала А.Я. Миркович. «И эта доска — единственный целый экспонат на историческом памятнике. Время нещадно разрушает само здание.

Здание главной усадьбы было построено в 1851 году, хотя благодаря удачному и живописному расположению село было известно гораздо раньше — со времен царя Ивана Грозного.Тогда село было вотчиной бояр Стрешневых, но в конце 18 века перешло к роду Чичериных: генерал-майору Александру Николаевичу и его жене Елизавете Петровне, урожденной Демидовой, внучке Григория Акинфиевича Демидова, одного из крупнейших производители железа и меди, создатель первого в России научного ботанического сада под Соликамском. Ее отец, Петр Григорьевич Демидов (1740-1826), с 1800 года в течение пяти лет занимал должность главного директора Санкт-Петербургского государственного университета им.Петербургское коммерческое училище.

Сама Елизавета Петровна известна как переводчик и писатель. Это имя вошло в словарь русских писателей 18 века. Ее дочь Екатерина Александровна Чичерина в 1822 году вышла замуж за Александра Яковлевича Мирковича (1792 — 1888). От этого брака в 1828 году родился сын Александр. Екатерина Александровна умерла в 1848 году, за 3 года до окончания строительства усадьбы.

Александр Яковлевич Миркович — потомок сербской знати, частник в войне 1812 года (прошел Витебск, Смоленск, Бородино) и заграничных походах (Люцен, Баутцен, Дрезден, Кульм, Лейпциг, Фер-Шампенуаз).За все эти походы был награжден орденом Святой Анны 4-й степени, крестом Кульма и золотым оружием за отвагу … Миркович вышел в отставку в 1854 году в звании генерал-майора. Главной заботой Александра Яковлевича было увековечение подвигов русского народа в Отечественной войне, он писал историю Лейб-гвардии кавалерийского полка, но, к сожалению, она так и не была напечатана. Миркович умер в Калуге, где и был похоронен.

Здание до 1917 года принадлежало потомкам героя Отечественной войны 1812 года.Как обычно, после Октябрьской революции все усадьбы были конфискованы новой властью, поэтому до 1932 года в усадьбе располагалась школа крестьянской молодежи, а затем Дом отдыха Союза писателей.

С августа 2005 г. памятник истории и культуры федерального значения передан в бесплатное пользование на 49 лет для создания в нем мемориального музея Героя Отечественной войны 1812 г., участника заграничных походов 1813-1814 гг. Участник Бородинского сражения, генерал-майор, рыцарь Александр Яковлевич Миркович… Основатели культурного центра являются его прямыми потомками.

К сожалению, поместье в очень плачевном состоянии и с таким отношением не просуществует еще 40 лет. Чтобы попасть внутрь, необходимо предварительно позвонить (мы этого не делали). Вход в половину подвала полностью открыт — ничего интересного, только большой слой мусора и сырости. Имущество требует капитальных вложений и ремонта, причем срочно.

Можно только догадываться, какой была усадьба раньше.На фото выше виден пруд и окружающие его тополя. Нет пруда и нет тополей. На высоком берегу с тыльной стороны Остались остатки лестницы, но спуститься по ним очень сложно. Скорее всего, здесь была беседка (а может и не одна — вид очень хороший). Панорама открывается с высокого берега Упы, центром которой являются белые стены Анастасова монастыря.

Очень надеюсь, что вопрос о сохранении такого памятника все-таки будет подниматься, и здание приведут в порядок.

А еще в Николо-Жупани находится кирпичная церковь Николая Чудотворца, построенная около 1701 года помещиками Стрешневыми. В церковь в 1918 г. на средства А.Я. Мирковича, в духе старинной церкви, пристроили трапезную с Владимирским и Александро-Невским приделами и колокольню. На сегодняшний день храм разрушен, осталась только трапезная.

Ну как обычно: если есть ошибки, ткните носом и строго не судите)))

Село Николо-Жупан находится совсем недалеко от города Одоев.Многие, кто хоть раз ехал из Тулы в Белев, заметили с дороги интересный дом, возвышающийся в зарослях над берегом Упы. Давно хотел побывать в этом месте, но, как обычно, все произошло совершенно случайно. Итак, нас ждет небольшая прогулка по усадьбе генерала Мирковича.

Для начала окунемся в историю этого места.

Когда появилось современное название Николо-Жупан, неизвестно, но еще во времена Ивана Грозного это место принадлежало боярам Стрешневым.Название «Сельцо упан» впервые упоминается в документах от 1566 года. В конце 18 века владельцем стал генерал-майор Чичерин, жена которого была из известной семьи Демидовых. В начале XIX века их дочь вышла замуж за генерала Александра Мирковича, декабриста, героя Отечественной войны 1812 года. Именно он в 1851 году завершил строительство главного дома своей усадьбы в стиле классицизма. .

Имение в Николо-Жупани находилось во владении Мирковичей до революции 1917 года, когда большая часть дворянских домов в России стала национальной собственностью.Позже в главном доме разместилась школа крестьянской молодежи.

Источник: odoevng.ucoz.ru

Интересно, что в те времена внутри сохранилась благородная мебель и предметы интерьера.

Источник: odoevng.ucoz.ru

Позже кто-то решил, что крестьянским детям слишком «толсто» ходить по дорогим паркетным полам и учиться в роскошных классах, поэтому в 1932 году здесь открылся Дом отдыха Союза писателей. . В это время здесь отдыхали многие известные писатели, в том числе лауреат Нобелевской премии Борис Пастернак.

Источник: myslo.ru

Незадолго до войны «Металлист» был здесь раньше всех.

Источник: myslo.ru

Во время войны немцы устроили в усадьбе конюшню, а огромная старая библиотека сгорела. В начале 50-х усадьбу отреставрировали, и здесь разместился детский дом.

С 1953 по 1974 год в усадьбе располагался детский дом. Позже мемориальное здание использовалось как общежитие для сотрудников детского дома, когда сам детский дом получил новое здание.

Источник: bergamotblog.blogspot.ru

Источник: geraldika.org

В 1998 году здесь размещался Интернет-дом для сотрудников, а подвал использовался как овощной магазин. Сейчас, хотя усадьба считается памятником архитектуры федерального значения, состояние ее очень плачевное.

Здание от разрушения пытались сохранить:

Сохранять большую часть фасада уже поздно:

Грустно смотреть, как такое красивое здание рушится буквально по частям:

Деревянная пристройка:

В 2001 году на усадьбе была повешена мемориальная доска:

Фасад, обращенный к Upa:

Если хотите, можете посетить подвал, но на этот раз я этого не сделал. Не хочется пачкаться, особенно в подвалах мало что может быть интересного:

Дом уже засажен деревьями:

Сохранились остатки деревянной лестницы, ведущей на берег:

Там скамейку оборудовали:

Имение генерала Мирковича показалось мне отличным местом, где я могу провести боевую проверку на своем новом экране квадрокоптера:

Несколько фото вверху:

Слева от современного здания интернет-дом, огороженный забором вместе в яблоневом саду, а в конце дороги, уходящей между заборами, остатки церкви Св.Николая Чудотворца видны, но об этом чуть позже:

Напротив усадьбы еще одно здание, которое вполне могло принадлежать усадьбе, но, скорее всего, что-то более современное:

со всех сторон:

Надпись на двери гласит — «Государственное стационарное учреждение системы социального обслуживания населения»:

Храм в Николо-Жупани возведен в начале 18 века, и это был четырехместный номер, над которым возвышался высокий восьмиугольник с фонарем, несущим луковицу.В 1820-е гг. Мирковичи пристроили по бокам трапезной две приделы:

«Движущая сила здесь — не светлое будущее федерального памятника. Иначе совместными усилиями с госструктурами усадьба была бы давно отреставрирована».

Евгения Твардовская

Недавно Инспекция Тульской области по государственной охране объектов культурного наследия подняла на заседании областного правительства вопрос о плачевном состоянии усадьбы героя Отечественной войны 1812 года генерала Мирковича в селе Николо-Жупана Одоевского района.Памятник федерального значения был передан в 2005 году по договору безвозмездного пользования потомкам славной семьи. Это был первый случай «мягкой» реституции в Тульской области. Сюжет получил широкое распространение в СМИ. Вскоре в доме открылся небольшой частный музей, появилась мемориальная доска, а усадьба стала известна далеко за пределами области.

Тогда, в середине 2000-х, в редком интервью или обзоре на тему государственно-частного партнерства при реставрации памятников архитектуры Николо-Жупани не упоминался как положительный и многообещающий пример.

Спустя десять лет выясняется, что реставрация вовсе не началась, ее срок — 2014 год — прошел, а частые гости в Николо-Жупани — сотрудники правоохранительных и других контролирующих органов.

«Почему взяли 500 тысяч и довольны?»

Инспекция по охране памятников Тульской области в сентябре 2015 года произвела контрольный выезд на объект и пришла к выводу «об ухудшении технического состояния в период нахождения здания у пользователя.В настоящий момент «Дом Мирковича» находится в аварийном состоянии, что зафиксировано актами осмотра ».

Магистратский суд Москвы, в который подчиняется региональный госорган, уже оштрафовал владельца «Николо-Жупани» на общую сумму 500 тысяч рублей. НО Прокурор Тульской области Александр Козлов на упомянутом заседании отметил, что в отношении пользователя его ведомство начало проверку — по обращению жителя села, который также указал на уничтожение усадьбы.

Председатель правительства области Юрий Андрианов раскритиковал отчет госоргана безопасности, заявив, что инспекция, в свою очередь, не доработала вопрос: «Значит, нам нужно снова обращаться в суд. Если памятник нам важен, то мы должны заставить ее отремонтировать его. Почему мы взяли 500 тысяч и рады, что внесли их в бюджет? И памятник в это время разрушается », — сказал он, предложив Инспекции совместно с Министерством культуры области добиться восстановления усадьбы.

«Следует признать очевидный факт: одни наследники не справятся»

Фотоотчет о разрушении в Николо-Жупани, приложенный к отчету Тульской инспекции, как говорится, говорит сам за себя. Казалось бы, все предельно ясно, логично и справедливо: обещали — не сделали. Если они этого не делали, их наказывали.

Но возникает ряд вопросов: зачем, собственно, такая история нужна новым-старым хозяевам? Сами ли они заинтересованы в руинах, а не в восстановлении родового гнезда?

Почему установили мемориальные доски — в «доме Мирковича» в Николо-Жупани и на месте захоронения других представителей его семьи в Санкт-Петербурге.В Петербурге, почему они работают в архивах и делают доклады по истории семьи на конференциях от Москвы до Екатеринбурга и за рубежом?

Почему, наконец, в доме сделали косметический ремонт, зачем устроили в нем экспозицию, предметы которой часто представлены на различных выставках в Туле и Москве, в частности, в Храме Христа Спасителя? Почему их деятельность отмечена благодарностью министра культуры РФ и многими другими благодарственными письмами и наградами?

Ответов может быть много, но как-то все это не похоже на действия инвесторов, которые ждут, когда дом окончательно рухнет, чтобы построить на его месте, например, спа-отель.

Также было бы очень интересно понять, что такое региональный государственный орган по охране памятников и органы местного самоуправления? Неужели в одних только меры контроля и штрафы? Ведь еще в 2013 году, скажем, приехавшим тульским журналистам было ясно, что «надо признать очевидный факт: в одиночку наследники не справятся. Объем работ огромен, и нужно много денег. По самым скромным подсчетам, реставрация одной только главной усадьбы обойдется в 1 доллар.5 миллионов. «

«Ни один здравомыслящий человек не станет вкладывать деньги в дом и землю, вокруг которых бесконечные дворы».

Примечательно, что в открытых источниках много написано о «саботаже» нынешних владельцев, но нигде их речь, как говорится, от первого лица. Хранители Наследия решили восполнить этот пробел. Итак, история неудачной реставрации Николо-Жупани — глазами Директор АНО «Культурный центр« Усадьба Генерала Мирковича » Ольга Троицкая-Миркович :

«Да, формально правда на стороне истца.Реставрация, которая по договору об обеспечительных обязательствах должна была быть проведена в 2014 году УК «Усадьба генерала Мирковича», не проводилась. Из местных СМИ на нас обрушивается поток обвинений — что мы якобы получаем дотации на имение, что используем их для личного обогащения; что местная администрация дает нам земельные участки рядом с домом, которые мы берем, а потом отказываем из-за «непомерных аппетитов»; что из-за нас на улице были жильцы, когда-то прописанные в имении и т. д.пр.

Увы, за 15 лет, которые наша семья полностью посвятила родовой усадьбе, мы не только ведем научную работу, не только начали разбираться в охране памятников, но и узнали, что значит бесконечно выбивать пороги офисов и обращаться в суды.

Рад, что сегодня имение генерала Мирковича — это узнаваемый бренд. Вместе с Ясной Поляной и Поленовым ее предполагается включить в пилотный проект «Русские усадьбы», который разрабатывается при поддержке Минкульта РФ.Уже сегодня он включен в маршрут «Древний Одоев и его окрестности».

В доме Мирковича находится временная выставка, которая представляет историю усадьбы и ее владельцев, полностью созданную нашей семьей. В День Одоева мы проводим в усадьбе «День открытых дверей»; Дом Мирковича всегда открыт для школьников района и детей соседнего Николо-Жупанского детского дома. К нам стали приезжать туристы из других городов.

В этом нам никто не помогает.Да мы не спрашиваем, лишь бы они не мешали. Но вот только с этим с самого начала проблемы.

Они не могли заключить с нами договор на бесплатное пользование пять (!) Лет. А все потому, что местная администрация, узнав о планируемом переносе памятника, сразу зарегистрировала в доме 24 жителя. Как позже установит прокуратура Одоевского района — незаконно, так как дом никогда не был жилым фондом.Администрация Одоева в 2005 году дала письменное обязательство переселить людей, которое до сих пор не выполнено. Более того, несмотря на заявления прокуратуры, недавно в мемориальном здании были зарегистрированы младенец и гражданин, вернувшиеся из мест содержания под стражей.

Скажите, а как вы можете провести и профинансировать восстановление дома, если на самом деле вы не являетесь его владельцем?

Усадьба Мирковичей — это не только дом, но и земельный участок, хозяйственные постройки, в частности ныне разрушенная рига и флигель, Никольский храм, который балансодержатель использует как склад.

Понятно, что для создания полноценного туристического комплекса их нужно реанимировать; под застройку нужен участок около дома. Именно это и было предусмотрено договором о передаче нам поместья в безвозмездное пользование.

Но на самом деле мы получили только главный дом. Все наши попытки захватить близлежащие объекты встречают пассивное или активное сопротивление или даже откровенный саботаж. Только так я могу оценить случай 2013 года, когда буквально в пяти метрах от западного фасада дома Мирковича были срублены старые реликтовые тополя, или другой случай, когда на земельном участке усадьбы была вырыта яма, якобы для строительства бассейн.Как нетрудно догадаться, мы ликвидировали последствия за свой счет.

Нам не дают в аренду участки с разрушенной застройкой, а нам предложили земельный участок с разрешенным использованием для индивидуального жилищного строительства (!), Хотя любое строительство на территории усадьбы категорически запрещено.

У меня были инвесторы, которые были готовы «вложить» в усадьбу, построить музейно-туристический комплекс, но ни один здравомыслящий человек не стал вкладывать деньги в дом и землю, вокруг которых бесконечные суды, статус которых неопределен и права собственности не формализованы.Это ответ на вопрос, почему не проводится реставрация и улучшение.

10 апреля 2014 года Губернатор Тульской области В.С. Груздев. Мы с местными жителями просто стояли по дороге со знаменем Дома Мирковича, чтобы привлечь его внимание. Нам удалось поговорить с ним и рассказать о своих проблемах. Тогда местные власти «отреагировали» быстро. Спустя несколько месяцев, например, было предоставлено жилье молодой маме с младенцем, занесенным в памятник.

Таким образом, администрация Одоевского района уже много лет не дает нам возможности выполнять взятые на себя обязательства по договору. А заодно пишет на нас жалобы в Министерство культуры и туризма Тульской области, что мы делаем недостаточно для сохранения памятника, после чего был составлен протокол об административном правонарушении за невыполнение нашим Центром его защитные обязательства.

Все это не может не свидетельствовать о том, что местная администрация стремится разорвать договор и не хочет, чтобы мы были пользователями имения.Судя по всему, это стало известным местом, которое просто хотят передать кому-то другому — для дальнейшего продвижения и развития. Для меня очевидно, что движущим мотивом здесь является не светлое будущее федерального памятника как объекта культуры. Иначе совместными усилиями с госструктурами усадьба Мирковичей давно бы восстановили и благоустроили. «

Для нашего сайта Вера Стерлина, руководитель Некоммерческого партнерства «Русская усадьба», лауреат Всероссийской премии «Хранители наследия» 2015 года, комментирует ситуацию:

«Очень жаль, что реставрация этого интересного и ценного комплекса не сдвинулась с мертвой точки.Нет, конечно, никаких оснований не доверять выводам регионального органа по охране культурного наследия о невыполнении охранных обязательств в установленные сроки … Но нельзя не учитывать, что если бы не нынешние пользователи, которые как могли, старались вдохнуть в усадьбу новую жизнь, скорее всего, ее просто не было бы — разобрали бы по кирпичику ».

Рекомбинантных вирусов осповакцины, кодирующих трансгены белков, индуцирующих апоптоз, усиливают апоптоз, но не иммуногенность инфицированных опухолевых клеток

Генетические модификации вируса осповакцины (VV) улучшают селективное инфицирование и гибель опухолевых клеток, а также активацию противоопухолевого иммунитета.Мы сконструировали двойной рекомбинантный VV, кодирующий человеческий GM-CSF, и индуцирующий апоптоз белок апоптин (VV-GMCSF-Apo) для сравнения с ранее сконструированным двойным рекомбинантным VV-GMCSF-Lact, кодирующим другой индуцирующий апоптоз белок, лактаптин, которые активировали пути гибели клеток, отличные от апоптина. Мы показали, что оба этих рекомбинантных VV более значительно активировали набор критических маркеров апоптоза в инфицированных клетках, чем рекомбинантный VV, кодирующий только GM-CSF (VV-GMCSF-dGF): это была экстернализация фосфатидилсерина, активация каспазы-3 и каспазы-7, Фрагментация ДНК и активация проапоптотического белка BAX.Однако только VV-GMCSF-Lact эффективно снижал потенциал митохондриальной мембраны инфицированных раковых клеток. Исследуя иммуногенные маркеры клеточной смерти в раковых клетках, инфицированных рекомбинантными VV, мы продемонстрировали, что все протестированные рекомбинантные VV эффективны в экстернализации кальретикулина и HSP70, снижении клеточного HMGB1 и секреции АТФ. Сравнение противоопухолевой активности против распространенной опухоли MDA-MB-231 показало, что оба рекомбинанта VV-GMCSF-Lact и VV-GMCSF-Apo эффективно замедляют рост опухоли.Наши результаты демонстрируют, что состав GM-CSF и белков, индуцирующих апоптоз, в геноме VV является очень эффективным инструментом для специфического уничтожения раковых клеток и для активации противоопухолевого иммунитета.

1. Введение

Онколитические вирусы — это новые многофункциональные противораковые агенты, результаты которых у пациентов становятся все более многообещающими [1]. Они могут непосредственно лизировать опухолевые клетки и быть векторами, кодирующими специфические молекулы (белки или РНК с регуляторными функциями), которые помогают убивать или подавлять рост опухолевых клеток и стимулировать иммунную систему [2].Вирусные белки взаимодействуют с рядом внутриклеточных сигнальных путей; таким образом, ожидается, что они обладают потенциалом для регулирования различных способов гибели клеток. К ним относятся апоптоз, некроз, некроптоз, пироптоз и аутофагическая гибель клеток, часто одна из которых является преобладающей формой смерти для конкретного OV [3]. Подавляющее большинство аденовирусов вызывает гибель аутофагических клеток [4]. Высокоаттенуированный вирус осповакцины, GLV-1h68, преимущественно подавляет антиапоптотические белки, что приводит к общему сдвигу в экспрессии белков внутри клетки, благоприятствуя апоптозу, тогда как дикий VV вызывает преимущественно запрограммированный некроз [3, 5-7].Более того, ранее считалось, что реовирус вызывает апоптоз инфицированных клеток, но новая молекулярная классификация указывает на гибель клеток, вызванную реовирусом, как некроптоз в дополнение к апоптозу [8, 9]. Поскольку OV обычно кодируют многие белки, помогая вирусам избегать иммунного ответа хозяина, для преодоления такой иммуносупрессии были сконструированы различные рекомбинантные OV с цитокинами или другими иммуностимулирующими молекулами [10–12]. Действительно, рекомбинантные VV, экспрессирующие иммуностимулирующий трансген, например GM-CSF или лиганд CD40, обладали повышенной терапевтической активностью против различных опухолей [13-15].

Аттенуированный вирус осповакцины показал большой потенциал в качестве онколитического вируса, обладающего безопасностью и некоторой эффективностью в доклинических и клинических испытаниях [16]. Большой геном VV может легко принимать вставки чужеродных генов без существенного нарушения репликации вируса. Более того, цитоплазматическая локализация вирусных частиц в клетках-хозяевах предотвращает вмешательство вирусной ДНК в клеточную ДНК. Эти свойства позволяют различные манипуляции с геномом осповакцины для конструирования рекомбинантных VV с усиленным противоопухолевым действием.Недавно было показано, что несколько классов химиотерапевтических средств вызывают иммуногенную гибель клеток (ICD), которая характеризуется высвобождением иммуномодулирующих молекул, которые активируют антигенпрезентирующие клетки и, таким образом, запускают индукцию более мощных противоопухолевых адаптивных иммунных ответов с опухолеспецифическим иммунным ответом. развитие памяти [17, 18]. Преапоптотическое воздействие кальретикулина (CRT), постапоптотическое высвобождение высокоподвижного белка группы 1 (HMGB1), секреция аденозинтрифосфата (АТФ) и их взаимодействие с рецепторами фагоцитоза необходимы для ICD и противоопухолевого иммунитета [19].Кроме того, появляются доказательства того, что определенные онколитические вирусы и обычные индукторы ИКД (химиотерапевтические препараты и УФ-излучение) активируют сходную реакцию на опасность, приводя к противораковому иммунитету [3, 20–23].

Хотя было показано, что вирус осповакцины предпочтительно запускает запрограммированный некроз, в нашем предыдущем исследовании мы сообщили, что двойной рекомбинантный вирус осповакцины VV-GMCSF-Lact, кодирующий проапоптотический белок лактаптин и GM-CSF человека, индуцировал гибель раковых клеток с помощью каспазы-3. активация каспазы-7 [6, 24].Тем не менее, влияние VV-GMCSF-Lact на другие элементы контрольной точки апоптотического каскада, а также индукцию иммуногенной гибели клеток еще не исследовано. Мы также ранее сконструировали рекомбинантный вирус осповакцины VVdGF-ApoS24 / 2, кодирующий апоптин, и этот вирус проявлял значительно более высокую селективную литическую активность в раковых клетках человека, чем исходный штамм L-IVP [25]. Апоптин (или белок VP3), неструктурный белок 14 кДа из вируса анемии цыплят, который специфически убивает опухолевые клетки, был выбран в качестве трансгена для создания других двойных рекомбинантных VV [26, 27].Здесь мы попытались понять, могут ли VV, вооруженные белками, индуцирующими апоптоз, сдвигать тип смерти инфицированных опухолевых клеток с некроза на апоптоз. Нашей дополнительной целью было испытать такие рекомбинантные VV на индукцию иммуногенной гибели раковых клеток in vitro.

2. Материалы и методы

2.1. Клетки и животные

Фибробласты почек африканских зеленых мартышек (CV-1) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC; Manassas, VA). Клетки мышиной лимфосаркомы RLS были щедро предоставлены доктором.Каледин В.И. (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия). Рабдомиосаркома мыши MX-7 и аденокарцинома молочной железы человека MDA-MB-231 были получены из Российской коллекции клеточных культур (Российское отделение ETCS, Санкт-Петербург, Россия). Клетки поддерживали, как было опубликовано ранее [28].

Самок мышей SCID (возраст 6–8 недель, линия SHO-PRKDC SCID HR / HR1EW 43375) были получены из вивария SPF Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия.

2.2. Рекомбинантные VACV

Штамм Lister (L-IVP) VV был получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных и риккетсиозных заболеваний Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Россия. Рекомбинантные вирусы осповакцины, VV-GMCSF-dGF и VV-GMCSF-Lact, были сконструированы из L-IVP и очищены, как описано ранее [24]. VVdGF-ApoS24 / 2 использовали в качестве родительского вируса для гомологичной рекомбинации кДНК человека GM-CSF в структурную часть локуса tk [25, 28, 29].Полученный VV-GMCSF-Apo представляет собой двойной рекомбинантный VV с трансгеном GM-CSF в локусе tk и с трансгеном апоптина в факторе роста вируса (vgf) с делецией. Кассета экспрессии апоптина включает промотор VV, последовательность синтетического гена апоптина и последовательность, кодирующую FLAG. Структура рекомбинантного VV-GMCSF-Apo была подтверждена секвенированием обоих штаммов ДНК с праймерами 5′-CAGAATTAATTAGACGAGTTAGACG (смысл TK-flank1) и 5′-TCTCGGTTTCCTCACCCAAT (TK-flank1 as) для области tk’ и 5 GTAAGCAAAGAATATAAGAATGAAGCGGTAATGAT (Up35) и 5′-CGAGCACAATACCGGGAGATGG (Apa-L22) для области vgf .Экспрессию GM-CSF и апоптина проверяли методом вестерн-блоттинга, как описано в [24, 25].

2.3. Анализ вирулентности рекомбинантных вариантов VV в яйцах (куриных эмбрионах)

Десятидневные куриные эмбриональные яйца инокулировали в хориоаллантоисные мембраны с помощью VV в десятикратных разведениях [30]. Диапазон разведения был выбран таким образом, чтобы самая высокая доза вируса вызывала гибель всех эмбрионов, а самая низкая доза вызывала гибель ни одного эмбриона. Начальный титр всех VV, измеренный in vitro с помощью анализа бляшек на монослое клеток CV-1, составлял 1.0 × 10 ⁹ БОЕ / мл. Диапазон разведения в наших экспериментах составлял 10 ¹ –10 ⁷ БОЕ / яйцо для каждого варианта VV, что соответствует дозам инфекции 10 ⁷ –10 ¹ БОЕ / яйцо. Каждый рекомбинантный VV разводили в десяти повторностях (10 эмбрионов). Через 48 ч после заражения яйца вскрывали и визуально определяли жизнеспособность эмбриона. Значение 50% летальной дозы куриных эмбрионов (LD ₅₀ ) рассчитывали по методу Карбера. LD ₅₀ выражали как десятикратное разведение, вызывающее 50% гибель эмбрионов.

2.4. Анализ уничтожения клеток in vitro

Опухолевые клетки высевали из расчета 1,5 × 10 ⁴ клеток на лунку на 96-луночные планшеты. На следующий день к клеткам добавляли рекомбинантные вирусы и инкубировали 72 часа. Во время инкубации клетки анализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad), и окончательную жизнеспособность определяли с помощью теста MTT, как описано ранее [24].

2.5. Проточная цитометрия

Все анализы были выполнены с использованием проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси), а данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences).Первоначально клетки были заблокированы (P1) на основе прямого и бокового рассеяния, чтобы исключить мелкий мусор, и было собрано десять тысяч событий из этой популяции.

Для обнаружения апоптоза клетки собирали трипсином и окрашивали аннексином V-FITC и PI с использованием набора BD Pharmingen Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) в соответствии с протоколом производителя. Популяции клеток с фенотипом аннексина V ^— / PI ^— были сконструированы как живые клетки, аннексин V ⁺ / PI ^— как апоптотические клетки и аннексин V ⁺ / PI ⁺ как вторичные некротические клетки .Активация каспазы-3 и каспазы-7 была обнаружена, как описано ранее [24]. Вкратце, все отслоившиеся и инфицированные адгезивом клетки инкубировали с рабочим раствором FLICA из набора Vibrant FAM Caspase-3 и Caspase-7 Assay Kit (каталожный номер V35118, молекулярные зонды от Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя.

Для обнаружения изменений потенциала митохондриальной мембраны () инфицированные клетки инкубировали с 5 мк мкг / мл JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-тетрахлор-1,1′, 3, 3’-тетраэтилбензимидазолкарбоцианина иодид) (Sigma-Aldrich) в течение 20 мин при 37 ° C, отделены трипсином и проанализированы проточной цитометрией.Количество измененных клеток выражали как процент клеток со сдвигом излучения флуоресценции в канале FITC по сравнению с контрольными необработанными клетками.

Для обнаружения экзо-CRT или экзо-HSP70 клетки инкубировали с первичными кроличьими антителами против CRT (1: 100, Abcam, Великобритания) или мышиными антителами против HSP70 (1: 100, Abcam, Великобритания), разведенными в PBS, содержащем 10% FBS и 2% глицина в течение 1 ч при 23 ° C. Кроличий IgG (Thermo Fisher Scientific, США) или мышиный IgG (R&D, США) использовали в качестве изотипического контроля.Затем клетки дважды промывали PBS с последующей инкубацией в течение 1 часа с куриными антикроличьими антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 594 (1: 2000, Invitrogen, Бельгия) или козьими антимышиными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 555 (1: 2000). , Invitrogen, Бельгия).

2.6. Флуоресцентная микроскопия

Для микроскопического анализа изменений митохондриальных мембран в клетках MDA-MB-231 или MX-7 клетки высевали (1 × 10 ⁴ ) на 4-луночные предметные стекла (BD Falcon, Bedford, MA). обрабатывали рекомбинантными VV в течение 36 часов, а затем добавляли 5 мкг мкг / мл JC-1 в течение 20 минут.Окрашенные (нефиксированные) клетки визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop 2 PLUS (Carl Zeiss, GmbH).

2.7. Лестница ДНК

Цельную клеточную ДНК выделяли стандартной процедурой. Вкратце, в указанные моменты времени после инфицирования VV отслоившиеся и адгезивные клетки собирали и объединяли в PBS, лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис (pH 8,1), 10 мМ EDTA и 1% SDS, центрифугировали при 12000 × g в течение 10 мин, а супернатанты обрабатывали экстракционной смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25: 24: 1).После центрифугирования (14000 × g в течение 15 мин) водную фазу обрабатывали РНКазой A (5 мкг г / мл) при 37 ° C в течение 1 ч, и ДНК осаждали этанолом с 0,3 М NaAc, pH 5,3. Образцы ДНК анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле.

2.8. Анализ АТФ

Внеклеточный АТФ измеряли в кондиционированной среде с использованием набора для определения биолюминесценции ENLITEN ATP Assay System (Promega) на основе конверсии люциферин-люциферазы в соответствии со следующей реакцией:

АТФ + D-люциферин + O ₂ → Оксилюциферин + AMP + PPi + CO ₂ + Свет (560 нм).Для измерения силы света использовался люминометр CLARIOstar (BMG Labtech).

2.9. Вестерн-блот-анализ

Опухолевые клетки, инфицированные рекомбинантными VV, лизировали в буфере: 50 мМ Трис (pH 8,0), 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, содержащий 0,1% SDS, 1x полный коктейль ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) и 1 мМ PMSF. Образцы (30 мк г) разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) с помощью процедуры влажного блоттинга (100 В, 500 мА, 90 мин, 15 ° C). с использованием «Mighty Small Transphor» (GE healthcare Bio-Science AB, США).Иммунодетекцию проводили с использованием системы iBind (Life Technologies), iBind Cards (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) и антител: антитело ANTI-FLAG BioM2 (Sigma-Aldrich, F9291), BAX (1: 1000, Abcam), циклин B1 (1: 60, Sigma-Aldrich), тубулин (1: 200, Sigma-Aldrich), GAPDH (1: 100, R&D) и HMGB1 (1: 6000, Abcam) и с использованием козьих антимышиных поликлональных IgG, конъюгированных с HRP (1: 200, Abcam) или ослиных антител к козьим HRP-конъюгированным IgG (1: 200, R&D) в качестве вторичных антител с набором реагентов хемилюминесцентного субстрата Novex ECL HRP (Invitrogen, США).Для детектирования люминесценции использовали блот-сканер C-DiGit (Li-COR Bioscience). Денситометрический анализ данных вестерн-блоттинга проводили с использованием программного обеспечения для анализа изображений Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics) версии 3.1.

2.10. Эксперимент на мышах

Все процедуры с участием животных выполнялись в соответствии с протоколами и рекомендациями по надлежащему использованию и уходу за лабораторными животными (Директива ECC 86/609 / EEC). Протокол одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Управления Сибирского отделения Российской академии наук.Самкам мышей SCID подкожно вводили 1 × 10 ⁶ опухолевых клеток MDA-MB-231. Когда опухолевые узлы достигли примерно 200 мм ³ , животные были разделены на группы и получили две внутриопухолевые инъекции рекомбинантного VV (100 мк л, 1 × 10 ⁷ БОЕ / мышь) или физиологического раствора в контрольной группе, как указано. в результатах. После первой инъекции дважды в неделю измеряли объем опухоли и вес мыши.

2.11. Статистический анализ

Тест Стьюдента использовали для сравнения лечебных эффектов в клеточных экспериментах.Для экспериментов на мышах данные выражены как среднее ± стандартная ошибка. Для сравнения между двумя группами использовался критерий Манна – Уитни. Значение менее 0,05 считалось значимым.

3. Результаты

3.1. Апоптин-кодирующий рекомбинантный вирус осповакцины

Новый двойной рекомбинантный вирус осповакцины, VV-GMCSF-Apo, несущий GM-CSF и апоптин в качестве трансгенов, был сконструирован для сравнения онколитического действия VV, кодирующих различные индуцирующие апоптоз белки. Последовательность GM-CSF вставляли в структурную часть гена вирусной тимидинкиназы (tk) , а последовательность апоптина вставляли в область с делецией гена фактора роста осповакцины (vgf) .Трансген апоптина содержал полноразмерную последовательность кодирующей области белка VP3 (AF3

, нуклеотиды 465-830, GenBank) вируса анемии цыплят, и отсутствовала лидерная последовательность для секреции. Инженерная схема VV-GMCSF-Apo была такой же, как для кодирующего лактаптин VV-GMCSF-Lact, описанного ранее [24]. Структура рекомбинантного вируса была подтверждена как анализом ПЦР со специфическими праймерами, так и секвенированием ДНК локусов tk и vgf (рис. 1 (а)).Используя праймеры для области гена tk , рекомбинантный VV-GMCSF-Apo продуцировал фрагмент 1760 п.н., который соответствует вставке гена gm-csf , тогда как родительский штамм L-IVP продуцировал фрагмент 414 п.н. При использовании праймеров для области гена vgf размер фрагмента рекомбинантного вируса со вставкой гена апоптина составлял 820 п.н. и 584 п.н. для штамма L-IVP (рис. 1 (b)). Внутриклеточную экспрессию апоптина в инфицированных клетках CV-1 исследовали с помощью вестерн-блоттинга с использованием коммерческих антител к эпитопу FLAG (рис. 1 (c)).

Для тестирования ослабления VV-GMCSF-Apo, а также VV-GMCSF-Lact, десятилетние куриные эмбрионы инфицировали различными дозами двойных рекомбинантных VV и родительского вируса L-IVP. LD ₅₀ рассчитывалась с использованием соотношения мертвых и живых эмбрионов после заражения. Мы обнаружили, что вирулентность VV-GMCSF-Apo и VV-GMCSF-Lact была в 158 и 100 раз ниже, чем у родительского штамма L-IVP, соответственно (Таблица 1).